Imagerie à monture entière pour visualiser et quantifier la structure, la morphologie et l’organisation des lentilles périphériques
Summary
Les protocoles actuels décrivent de nouvelles méthodes d’imagerie à monture entière pour la visualisation des structures périphériques du cristallin oculaire avec des méthodes de quantification d’image. Ces protocoles peuvent être utilisés dans le cadre d’études visant à mieux comprendre la relation entre les structures à l’échelle microscopique des lentilles et le développement/la fonction des lentilles.
Abstract
Le cristallin oculaire est un tissu transparent et flexible qui modifie sa forme pour focaliser la lumière à différentes distances sur la rétine. Mis à part une membrane basale entourant l’organe, appelée capsule, le cristallin est entièrement cellulaire composé d’une monocouche de cellules épithéliales sur l’hémisphère antérieur et d’une masse en vrac de cellules de fibres de cristallin. Tout au long de la vie, les cellules épithéliales prolifèrent dans la zone germinative à l’équateur du cristallin, et les cellules épithéliales équatoriales migrent, s’allongent et se différencient en cellules fibreuses nouvellement formées. Les cellules épithéliales équatoriales modifient considérablement la morphologie, passant de cellules en forme de galets emballées au hasard à des cellules alignées en forme d’hexagone formant des rangées méridiennes. Les cellules de fibres de lentilles nouvellement formées conservent la forme hexagonale des cellules et s’allongent vers les pôles antérieur et postérieur, formant une nouvelle coquille de cellules qui se superposent aux générations précédentes de fibres. On sait peu de choses sur les mécanismes qui conduisent à la remarquable morphogenèse des cellules épithéliales du cristallin en cellules fibreuses. Pour mieux comprendre la structure, le développement et la fonction des lentilles, de nouveaux protocoles d’imagerie ont été développés pour imager les structures périphériques à l’aide de montures entières de lentilles oculaires. Ici, les méthodes permettant de quantifier l’épaisseur de la capsule, la surface des cellules épithéliales, la zone et la forme du noyau cellulaire, l’ordre et l’emballage des cellules de la rangée méridionale et la largeur des cellules des fibres sont présentées. Ces mesures sont essentielles pour élucider les changements cellulaires qui se produisent au cours de la croissance du cristallin tout au long de la vie et comprendre les changements qui se produisent avec l’âge ou la pathologie.
Introduction
Le cristallin oculaire est un tissu flexible et transparent situé dans la région antérieure de l’œil qui a pour fonction de focaliser finement la lumière sur la rétine. La capacité de l’objectif à fonctionner peut être attribuée, en partie, à son architecture complexe et à son organisation 1,2,3,4,5,6. Autour du tissu du cristallin se trouve la capsule, une membrane basale essentielle au maintien de la structure du cristallin et des propriétés biomécaniques 7,8,9. Le cristallin lui-même est entièrement cellulaire, composé de deux types de cellules : les cellules épithéliales et les cellules fibreuses. La couche épithéliale est constituée d’une monocouche de cellules cuboïdes qui recouvrent l’hémisphère antérieur du cristallin10. Tout au long de la vie, les cellules épithéliales prolifèrent et migrent le long de la capsule du cristallin vers l’équateur du cristallin. Les cellules épithéliales antérieures sont au repos et en forme de galets en coupe transversale, et près de l’équateur du cristallin, les cellules épithéliales prolifèrent et commencent à subir le processus de différenciation en nouvelles cellules fibreuses11,12. Les cellules épithéliales équatoriales se transforment de cellules emballées au hasard en rangées méridiennes organisées avec des cellules en forme d’hexagone. La forme hexagonale des cellules est maintenue sur la face basale de ces cellules de différenciation tandis que la face apicale se contracte et s’ancre au point d’appui du cristallin ou modiolus 4,13,14,15. Au fur et à mesure que les cellules épithéliales équatoriales commencent à s’allonger en cellules fibreuses nouvellement formées, les extrémités apicales des cellules migrent le long de la surface apicale des cellules épithéliales antérieures vers le pôle antérieur tandis que les extrémités basales se déplacent le long de la capsule du cristallin vers le pôle postérieur. Les nouvelles générations de cellules fibreuses se superposent aux générations précédentes de cellules, créant des coquilles sphériques de fibres. Au cours du processus d’élongation et de maturation des cellules, les cellules fibreuses modifient considérablement leur morphologie 11,12,16. Ces cellules fibreuses forment la majeure partie de la masse de la lentille 11,12,16,17,18.
Les mécanismes moléculaires qui contribuent à l’établissement de microstructures complexes du cristallin, de la morphologie cellulaire et de l’organisation cellulaire unique ne sont pas entièrement connus. De plus, la contribution de la capsule du cristallin et de la structure cellulaire à la fonction globale du cristallin (transparence, changement de forme du cristallin) n’est pas claire. Cependant, ces relations sont élucidées à l’aide d’une nouvelle méthodologie d’imagerie et d’évaluations quantitatives des caractéristiques structurelles et cellulaires du cristallin 2,4,19,20,21,22. De nouveaux protocoles d’imagerie de lentilles entières permettant une visualisation à haute résolution spatiale de la capsule du cristallin, des cellules épithéliales et des cellules de fibres périphériques ont été développés. Cela inclut une méthodologie pour quantifier l’épaisseur de la capsule, la taille des cellules, la taille et la circularité du noyau cellulaire, l’ordre des rangées méridionales, l’emballage des cellules fibreuses et la largeur des cellules fibreuses. Ces méthodes de visualisation et de quantification d’images permettent un examen morphométrique approfondi et présentent des avantages par rapport à d’autres méthodes de visualisation (imagerie de montages plats ou de coupes de tissus) en préservant la structure tissulaire 3D globale. Ces méthodes ont permis de tester de nouvelles hypothèses et permettront de continuer à faire progresser la compréhension du développement et de la fonction des cellules du cristallin.
Pour les expériences suivantes, nous utilisons des souris de type sauvage et Rosa26-tdTomato tandem dimère-Tomate (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) dans le fond C57BL/6J entre l’âge de 6 et 10 semaines, des deux sexes. Les souris tdTomato permettent de visualiser les membranes plasmiques cellulaires dans des lentilles vivantes via l’expression de la protéine tdTomato fusionnée aux 8 acides aminés N-terminaux d’une protéine MARCKS mutée qui cible la membrane plasmique via la myristylation N-terminale et les sites internes de cystéine-palmitoylation23. Nous utilisons également des souris NMIIAE1841K/E1841K 24 obtenues à l’origine auprès du Dr Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Comme décrit précédemment20, les souris NMIIAE1841K/E1841K dans un fond FvBN/129SvEv/C57Bl6 qui ont perdu la protéine de filament intermédiaire perlé CP49 (maintient la morphologie des cellules fibreuses matures et la biomécanique du cristallin entier), sont rétrocroisées avec des souris de type sauvage C57BL6/J. Nous avons dépisté la progéniture pour détecter la présence de l’allèle CP49 de type sauvage.
L’imagerie confocale a été réalisée sur un microscope confocal à fluorescence à balayage laser avec un grossissement de 20x (NA = 0,8, distance de travail = 0,55 mm, zoom 1x), de 40x (NA = objectif d’huile de 1,3, distance de travail = 0,2 mm, zoom 1x) ou de 63x (NA = objectif d’huile de 1,4, distance de travail = 0,19 mm, zoom 1x). Toutes les images ont été acquises à l’aide d’une taille de trou d’épingle, qui est un déterminant de l’épaisseur de la section optique, à 1 unité d’Airy (les épaisseurs optiques résultantes sont indiquées dans les légendes des figures). Les images ont été traitées sur Zen Software. Les images ont été exportées au format .tif, puis importées dans FIJI ImageJ Software (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits permettent une visualisation à haute résolution spatiale des structures et des cellules périphériques du cristallin dans les régions antérieures et équatoriales du cristallin. Dans cette étude, des méthodes de visualisation des structures périphériques des lentilles à l’aide de lentilles intactes (vivantes ou fixes) où l’architecture globale des lentilles 3D est préservée ont été présentées. De plus, des méthodes simples d’analyse morphométrique quantitative à l’aide …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la subvention R01 EY032056 du National Eye Institute à CC et R01 EY017724 à VMF, ainsi que par le National Institute of General Medical Sciences sous le numéro de subvention P20GM139760. S.T.I a été soutenu par le NIH-NIGMS T32-GM133395 dans le cadre du programme de formation prédoctorale Chemistry-Biology Interface, et par une bourse de bourses d’études supérieures de l’Université du Delaware.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
- Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
- Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
- Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
- Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
- Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
- Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
- Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
- Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
- Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
- Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
- Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
