Summary
نحن هنا يبرهن على وجود طريقة لحمل وتسجيل التقدم المحرز في رد فعل متأخر (DTH) نوع فرط في الأذن الفئران. اعقب ذلك عرض لإعداد الأنسجة الأذن الفئران لتصوير ثنائي الفوتون من المستجيب / الذاكرة استجابة الخلايا التائية.
Abstract
تأخر فرط نوع (DTH) هو رد الفعل المناعي الذي اللاعبين الرئيسيين هم CCR7 -- المستجيب / اللمفاويات التائية الذاكرة. هنا ، علينا أن نظهر وسيلة لحفز التقدم وتسجيل ردود فعل من البيوت في الأذن الفئران. اعقب ذلك عرض لإعداد الأنسجة الأذن الفئران لتصوير اثنين من الفوتون CCR7 -- المستجيب / الذاكرة استجابة الخلايا التائية.
هو أحد البيوت التي يسببها بالتبني من قبل حقن داخل الصفاق من GFP المسمى البويضات محددة CCR7 -- المستجيب / الذاكرة خط الخلايا التائية (Beeton ، C J. التجارب متصور ، العدد 8). ثم يتم السماح للتوازن الخلايا في الفئران لمدة 48 ساعة قبل التحدي عن طريق حقن أذن واحدة مع المياه المالحة (مراقبة الأذن) ، والآخر مع مزيج من مترافق 01:01 البويضات والبويضات الى تكساس الأحمر (OVA - TR) للسماح التصور الخلايا مستضد تقديم المقيمين.
نحن تصف طريقة لإعداد الأنسجة مفيدة لتصوير حركية من خلايا داخل طبقة الجلد العميقة خلال استجابة مناعية ، بالاشتراك مع التصور من ألياف الكولاجين التي التوافقي الجيل الثاني. يتم قطع نسيج الأذن إلى 5 مم X المربعات 5 (أكبر قليلا هو أفضل) والتي شنت على غطاء بلاستيكي باستخدام قسائم Vetbond ™ ، والتي يتم تأمينها ثم استخدام الشحوم سيليكون في غرفة التصوير وsuperfused بواسطة الأكسجين فقاعات نسيج الثقافة في المتوسط 37 درجة مئوية .
Protocol
تحريض DTH بالتبني
الرجاء راجع المقالة إن الرب : الاستقراء والرصد من فرط الحساسية المتأخرة نوع بالتبني في الفئران
كريستين Beeton جورج ك. شاندي
قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية في جامعة كاليفورنيا في ايرفين
تجارب J. متصور ، العدد 8
هنا ، ونحن قد عدلت هذا البروتوكول باستخدام المستضد (Ovalbumin) مترافق الى تكساس الأحمر في نسبة 1:1 مع مستضد غير المسماة للسماح التصور من الخلايا البلعمية مستضد تقديم.
الأذن الأنسجة الحصاد
- الموت ببطء والفئران عند نقطة في الوقت المطلوب عن طريق الإجراءات المحددة في البروتوكول الخاص الحيوانية المعتمدة. هنا ، فإننا نستخدم جرعة زائدة من المخدر ، isoflurane. يتم ذلك في حاوية مغلقة تقع داخل غطاء جيد التهوية. ضمان للحيوان ميت إما قطع الرأس من خلال فتح التجويف الصدري وقطع القلب.
- باستخدام مقص كبير إزالة قطع الأذن مع واحد ، على مقربة من جسم الحيوان قدر الإمكان (الشكل 1).
الشكل 1. إزالة الأذن الفئران - مكان الأذن في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على ~ 10 مل من 1X PBS الجليد الباردة أو RPMI 1640. الحفاظ على عينات الأنسجة على الجليد حتى تكون على استعداد لتحضير لتصوير الأنسجة.
- صورة الأنسجة في أقرب وقت ممكن ، ونحن نجد ، على الرغم من أن 1 إلى 2 ساعة على الجليد ليس له تأثير ملحوظ على حركية الخلية في الأنسجة عند مقارنة النسيج المقطوع والتقط على الفور.
التحضير لتصوير الأنسجة
أولا إزالة طبقة البشرة والجلد
* ملاحظة : يجب أن تبقى طبقة الجلد العميقة سليمة. إذا كان القيام به بشكل صحيح سوف الأوعية الدموية الكبيرة لا تزال سليمة وسوف لا يتعرض الغضروف في الأذن يكون. هذا هو أسلوب صعب ، وخصوصا عندما لا يوجد التهاب (شروط المراقبة) وانه من المفيد استخدام مجهر تشريح.
- مكان كل من الأنسجة وسائل الإعلام من الأنبوب المخروطية في صحن 10 سم زراعة الأنسجة.
- مع الاستمرار على أيدي القفاز الأذن الفئران بلطف على طرف الأذن (البعيدة) مع الجانب الظهري من الأذن مواجهة (الشكل 2).
الشكل 2. تقليم الفراء قبالة الأذن - مع إبهامك على أعلى الأذن ، والنسيج ثابتة أثناء استخدام غيض من دومون مغلقة # 5 المقص لفصل الأدمة العميقة من الأدمة. بدلا من ذلك ، إذا كان على حافة الأذن لديها فائض من الجلد / الأدمة العميقة ، يمكن اغتنامها هذا مع ملقط وسحبت بلطف لفصل هذه الأنسجة من تحت (الشكل 3).
الشكل 3. إزالة الأدمة العليا - مرة واحدة وقد تم فصل منطقة صغيرة من الجلد من الأنسجة الكامنة ، كرر الخطوات بدلا من الانفصال باستخدام مقص لقطع بين طبقات الجلد وملقط لإزالة بلطف وتقشر الجلد فكها.
- تكشف النقاب عن 5 × 5 ملم أو مساحة أكبر من أنسجة الأذن التي لا تقل عن 3 ملم من موقع الأولي لحقن المستضد (الشكل 4).
الشكل 4. الأنسجة تتعرض للتصوير
II. تأمين الأنسجة إلى مرحلة التصوير
- قطع من البلاستيك لتغطية زلة حجم أكبر قليلا من نسيج المعدة.
- انتشار طبقة رقيقة من نسيج Vetbond 3M ™ آمنة الغراء عبر الشريحة.
- فهم ركن من نسيج المعدة (حيث كنت من غير المحتمل أن الصورة) ، وترفع من وسائل الإعلام ، وربت الجانب السفلي من الأنسجة على الورق أو عدسة كيم مسح وسائل الإعلام لإزالة الزائدة.
- لمس حافة الأنسجة لتغطية الشريحة الغراء (ويشفي Vetbond فورا على النسيج الرطب). تمتد برفق الأنسجة شقة ، مع الطرف المقابل هو آخر من لمس الشريحة (الشكل 5)
الشكل 5. جبل نسيج لتغطية زلة - علاج ™ Vetbond بواسطة قلب النسيج عينة / الانزلاق والغمس في خزان من وسائل الاعلام ان هذه الشريحة والنسيج وجهه لأسفل وتقريبا بزاوية 45 درجة. عقد النسيج رأسا على عقب في زاوية يساعد على منع الغراء الزائد من على سطح علاج الأنسجة المكشوفة. والغراء على سطح النسيج كتلة ليزر (الشكل 6).
الشكل 6. شفاء الأنسجة vetbond حمض الغلوتاميكه عن طريق غمس في وسائل الإعلام
ملاحظة : خطوات 02-05 مايو يأخذ القليل من الممارسة لاتقان. حاول ممارسة القطع مع تجاهل أو الأنسجة الزائدة قبل محاولة للمرة الأولى. - ربت على كمية صغيرة من السيليكون الشحوم على الجزء السفلي من الشريحة.
- ضع الشريحة في غرفة الارواء. تأكد من أن وسائل الإعلام نضح تتدفق ، و 37 درجة مئوية ، والاوكسيجين قبل ان يضيف الأنسجة. اضغط برفق لأسفل على حواف الشريحة صنع ختم الشحوم مع السيليكون بين الجزء السفلي من الغرفة ، ونضح زلة غطاء من البلاستيك.
III. ثنائي الفوتون التصوير
- استخدام الضوء الساطع مجال المنقولة ، والتركيز على الجزء العلوي من الأنسجة. إيقاف كل الاضواء.
- بدوره على الليزر ، وهذه الفرق على النحو المطلوب من قبل النظام الخاص مجهر متعدد الفوتون.
- الجيل الثاني التوافقي (SHG) في البروتينات الليفية عالية أمر (الكولاجين والميوسين) تنتج إشارة في الطول الموجي النصف من الليزر الإثارة. نستخدم الإثارة في 900 نانومتر ، مما أدى إلى SHG عند 450 نانومتر التي يمكن تصور استخدام "الزرقاء" قناة المجهر. SHG جيل هو غير الخطية (ثنائي الفوتون) عملية ، ويوفر بالتالي البصرية "sectioning" تأثير مماثل لذلك من الإثارة اثنين من الفوتون مضان. كفاءة ذروة SHG يحدث عندما يتم ييفات عمودي على الليزر ، في حين أن الألياف تعمل في موازاة ذلك لا يمكن تصور 1
- موقع التصوير في منطقة جيدة مع الكثير من الخلايا ، وتعيين منطقتك اقتناء مثل هذه الغالبية من الخلايا الموجودة في المركز وبدء التصوير. ملاحظة : في ردود الفعل المباشرة الى البيوت ، وكثيرا ما توجد الخلايا التائية والخلايا الأخرى تتسرب إلى التركز معا بينما مناطق أخرى خالية من التسلل الى الخلايا 2. لذلك ، قد يستغرق بعض الوقت في البحث في النسيج للعثور على أفضل صورة للمنطقة.
- الاختيار لبقاء الخلية من خلال تقييم سرعة الخلية والاقطاب خلال التصوير. استخدام قوة أقل الليزر الذي يوفر جودة الصورة مقبولة لضمان الحد الأدنى من الصور والضرر.
- مبادلة في إعداد أنسجة جديدة حسب الحاجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
- Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
- Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
- Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. , In Press (2008).
