Cerebro del pez cebra ventrículo inyección

Este procedimiento comienza con la estadificación de los embriones de pez cebra. Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa de interés, retírelos del corion. A continuación, se crean agujeros en un plato recubierto de aros con una punta de pipeta para montar los embriones y los embriones se colocan suavemente en los agujeros con la cola hacia abajo.

Una vez que se montan los embriones, se inyecta cuidadosamente un troquel fluorescente en el espacio ventrículo del embrión a través del cerebro posterior. Después de la inyección del ventrículo, se obtienen imágenes de los embriones y los datos se procesan con Photoshop. Hola, soy Jennifer Gutman y pertenezco al laboratorio de la Dra. Hazel Sieve en el Instituto Whitehead de Investigación Biomédica del MIT en Cambridge, Massachusetts.

Hoy le mostraremos un procedimiento para la inyección del ventrículo cerebral del pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la formación del ventrículo cerebral y la morfogénesis neuroepitelial en el pez cebra vivo. Debido a la naturaleza de los embriones transparentes de pez cebra, la caracterización de la forma del ventrículo cerebral puede ser difícil.

Esta técnica es una forma útil y sencilla de diferenciar el espacio lleno de líquido del tejido circundante y de caracterizar embriones mutantes que pueden tener defectos en la formación de ventrículos cerebrales. Así que comencemos. Para prepararnos para inyectar el ventrículo cerebral del pez cebra, comenzamos haciendo las agujas de inyección.

La aguja polar de un instrumento Sutter se utiliza para tirar de las agujas capilares. Luego, la aguja capilar se llena con un tinte fluorescente, como la dextrina roja de Texas. A continuación, la aguja llena se monta en un micromanipulador en un aparato de microinyección.

Corta la aguja al tamaño apropiado en ángulo. Para crear una punta biselada, mida el tamaño de la gota de la aguja y compruebe que esté entre uno y dos nanolitros por inyección en aceite. Para comenzar esta etapa del procedimiento, los embriones, según Kimmel, en todos los embriones deben inyectarse 30 minutos antes de la etapa de interés.

Por ejemplo, para estudiar los ventrículos a las 24 horas después de la fecundación inyectar los embriones a las 23 horas y media después de la fecundación. El embrión en la etapa de interés se coloca bajo el microscopio estereoscópico y el corion se extrae cuidadosamente del embrión con fórceps. A continuación, se hace una placa de aros para los embriones utilizando una placa de plástico recubierta con agujeros de 1%aros en los aros con una punta de pipeta de plástico de uno a 200 microlitros.

Retire con cuidado los tapones aros de los orificios con pinzas. Transfiera el embrión y los medios embrionarios a la placa aros con agujeros. Agregue trica al medio para anestesiar el embrión y evitar el movimiento.

Durante el experimento, coloque suavemente la cola del embrión en el orificio y oriéntelo de modo que el aparato de inyección quede en la parte posterior del embrión. Ahora que el embrión está colocado y orientado correctamente en la placa surgida, estamos listos para la inyección en el ventrículo cerebral. Primero, organice la configuración de micromanipulación de modo que la punta de la aguja esté en el mismo campo de visión que el embrión a alta potencia.

Coloque con cuidado la aguja a través de la placa delgada del techo del cerebro posterior justo después del punto de bisagra R cero R un punto de bisagra sin golpear el tejido cerebral que se encuentra debajo, inyecte solo el tinte suficiente para llenar completamente los ventrículos. Pueden ser necesarias varias inyecciones para llenar el espacio ventrículo dependiendo de la etapa del embrión. Cuando el embrión ha sido inyectado y está listo para la toma de imágenes, se prepara una nueva placa de aros para el embrión.

Con un plato limpio recubierto de 1%aros, haga agujeros en el plato y retire los tapones. Transfiere el embrión a la placa y añade trica para anestesiar el embrión y evitar el movimiento. Coloque la cola del embrión inyectado en el ventrículo en el orificio en posición para obtener una imagen dorsal.

El embrión ya está listo para la toma de imágenes. Tome una imagen usando luz transmitida. Es muy importante no mover el embrión ni el microscopio.

A continuación, cambie la configuración del microscopio y tome una imagen con luz fluorescente. Reposicione el embrión para tomar imágenes laterales con luz transmitida y luz fluorescente. Guarde todas las imágenes como archivos para el procesamiento de imágenes de Photoshop.

Para procesar las imágenes en Photoshop, abra las imágenes de luz transmitida y luz fluorescente del mismo embrión tomadas en la misma posición. Asegúrese de que todos los ajustes sean los mismos Para cada imagen, arrastre su imagen fluorescente a la imagen de luz transmitida y alinéelas exactamente con la imagen fluorescente seleccionada. Seleccione los ajustes de imagen y, a continuación, reemplace el color y cambie el fondo negro a blanco.

En la ventana Reemplazar color, ajuste el factor de borrosidad a la derecha hasta que la imagen fluorescente tenga un color uniforme. En la ventana de capas, seleccione multiplicar. Para ver las imágenes superpuestas, la imagen del espacio ventrículo debe coincidir con la imagen de luz transmitida. Exactamente.

Guarde este archivo y repita el procedimiento para cualquier otra imagen. Si la inyección ventricular se realiza correctamente, las imágenes deben tener bordes nítidos en tinte no difuso como se muestra aquí en estas imágenes de 25 horas. Después de la fertilización, mientras que los embriones tipo, el panel A muestra la imagen de campo claro, el panel B muestra la imagen fluorescente y el panel C muestra la imagen superpuesta.

Por otro lado, si durante la inyección ventricular la aguja se inserta demasiado, entrará en el tejido cerebral por debajo del espacio ventricular y dará lugar a una inyección incorrecta. Esto da como resultado un tinte que es visible fuera del espacio ventricular y en la yema, como se muestra aquí. El panel E muestra la imagen de campo claro.

El panel F muestra la imagen fluorescente y el panel G muestra la imagen superpuesta. En el panel H se muestra una vista lateral de la imagen superpuesta. Las flechas indican las regiones en las que el tinte ha ido más allá del espacio del ventrículo cerebral. En este video, demostramos cómo inyectar tinte fluorescente en ventrículos cerebrales de pez cebra en desarrollo.

Este método se utiliza para visualizar el espacio ventrículo cerebral en contraste con el epitelio neuronótico circundante, y es extremadamente útil para determinar la forma del espacio ventrículo, así como la forma del tejido cerebral circundante. Esta técnica nos permite comprender mejor el proceso de formación del ventrículo cerebral y la morfogénesis cerebral a lo largo del tiempo en el embrión vivo. Es una excelente herramienta para estudiar los defectos de la formación del ventrículo cerebral y para la caracterización inicial de los mutantes de la morfogénesis cerebral.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.