Cerebro del pez cebra ventrículo inyección

Este procedimiento comienza con la clasificación por etapas de embriones de pez cebra. Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa de interés, retírelos de la coriona. A continuación, se crean orificios en una placa recubierta con aros utilizando la punta de una pipeta para montar los embriones, y estos se colocan suavemente en los orificios con la cola hacia abajo.

Después de montar los embriones, se inyecta cuidadosamente un colorante fluorescente en el espacio ventricular del embrión a través del cerebro posterior. Tras la inyección ventricular, se obtienen imágenes de los embriones y los datos se procesan utilizando Photoshop. Hola, soy Jennifer Gutman del laboratorio de la Dra. Hazel Sieve en el Instituto Whitehead para la Investigación Biomédica en el MIT en Cambridge, Massachusetts.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la inyección en los ventrículos cerebrales de pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la formación de los ventrículos cerebrales y la morfogénesis del epitelio neural en peces cebra vivos. Debido a la naturaleza de los embriones transparentes de pez cebra, caracterizar la forma de los ventrículos cerebrales puede resultar difícil.

Esta técnica es una forma útil y sencilla de diferenciar el espacio lleno de líquido del tejido circundante y de caracterizar embriones mutantes que podrían presentar defectos en la formación de los ventrículos cerebrales. Comencemos. Para prepararse para la inyección en el ventrículo cerebral de pez cebra, comenzamos fabricando las agujas de inyección.

Se utiliza un polar de aguja del instrumento Sutter para tirar de las agujas capilares. Luego, la aguja capilar se llena con un colorante fluorescente, como el dextrano rojo Texas. A continuación, la aguja cargada se monta en un micromanipulador del aparato de microinyección.

Corte la aguja al tamaño adecuado en un ángulo. Para crear una punta biselada, mida el tamaño de la gota de la aguja y verifique que esté entre uno y dos nanolitros por inyección en aceite. Para comenzar esta etapa del procedimiento, los embriones, según Kimmel, deben inyectarse 30 minutos antes que la etapa de interés.

Por ejemplo, para estudiar los ventrículos a las 24 horas post fertilización, inyecte los embriones a las 23 horas y media post fertilización. El embrión en la etapa de interés se coloca bajo el microscopio estereoscópico y se retira cuidadosamente el corion del embrión utilizando pinzas. A continuación, se prepara un platillo de aros para los embriones utilizando un recipiente de plástico recubierto con aros al 1 %; se hacen perforaciones en el aros con una punta de pipeta de plástico de 1 a 200 microlitros.

Retire cuidadosamente los tapones de aros de los orificios utilizando fórceps. Transfiera el embrión y el medio embrionario al recipiente de aros con orificios. Añada trica al medio para anestesiar al embrión y evitar su movimiento.

Durante el experimento, coloque suavemente la cola del embrión hacia abajo dentro del orificio y oriente de manera que el aparato de inyección quede en el lado posterior del embrión. Ahora que el embrión está colocado y orientado correctamente en la placa, estamos listos para la inyección en el ventrículo cerebral. Primero, ajuste el sistema de micro-manipulación de modo que la punta de la aguja esté en el mismo campo de visión que el embrión, con aumento elevado.

Introduzca cuidadosamente la aguja a través de la lámina delgada del techo del cerebro posterior, justo posterior al punto de articulación R cero R uno, sin tocar el tejido cerebral situado debajo; inyecte solo la cantidad de colorante necesaria para llenar completamente los ventrículos. Pueden ser necesarias varias inyecciones para llenar por completo el espacio ventricular, dependiendo del estadio del embrión. Una vez que el embrión ha sido inyectado y está listo para la obtención de imágenes, se prepara un nuevo plato aros para el embrión.

Utilizando un plato limpio recubierto con 1%aros, haga agujeros en el plato y retire los tapones. Transfiera el embrión al plato y agregue trica para anestesiar al embrión y evitar el movimiento. Coloque la cola del embrión inyectado en el ventrículo en el agujero en posición para obtener una imagen dorsal.

El embrión ya está listo para la obtención de imágenes. Tome una imagen utilizando luz transmitida. Es muy importante no mover el embrión ni el microscopio.

A continuación, cambie la configuración del microscopio y tome una imagen con luz fluorescente. Vuelva a colocar el embrión para obtener imágenes laterales con luz transmitida y luz fluorescente. Guarde todas las imágenes en archivos para el procesamiento de imágenes en Photoshop.

Para procesar las imágenes en Photoshop, abra las imágenes de luz transmitida y de luz fluorescente del mismo embrión tomadas en la misma posición. Asegúrese de que todos los ajustes sean iguales. Para cada imagen, arrastre la imagen fluorescente sobre la imagen de luz transmitida y alínelas exactamente con la imagen fluorescente seleccionada. Seleccione ajustes de imagen y luego reemplace el color, y cambie el fondo negro a blanco.

En la ventana de reemplazo de color, ajuste el factor de tolerancia hacia la derecha hasta que la imagen fluorescente tenga un color uniforme. En la ventana de capas, seleccione multiplicar. Para ver las imágenes superpuestas, su imagen del espacio ventricular debe coincidir exactamente con la imagen de luz transmitida.

Guarde este archivo y repita el procedimiento para cualquier otra imagen. Si la inyección en el ventrículo se realiza correctamente, las imágenes deben tener bordes nítidos y el colorante no debe estar difuso, como se muestra aquí en estas imágenes de 25 horas post-fecundación; los embriones de tipo salvaje, panel A muestra la imagen de campo brillante, el panel B muestra la imagen fluorescente y el panel C muestra la imagen superpuesta.

En el panel D se muestra una vista lateral de la imagen superpuesta. Por otro lado, si durante la inyección en el ventrículo la aguja se inserta demasiado, entrará en el tejido cerebral por debajo del espacio ventricular y provocará una inyección incorrecta. Esto da como resultado un tinte visible fuera del espacio ventricular y en la yema, tal como se muestra aquí. El panel E muestra la imagen de campo brillante.

El panel F muestra la imagen fluorescente y el panel G muestra la imagen superpuesta. Se presenta una vista lateral de la imagen superpuesta en el panel H. Las flechas indican regiones donde el colorante ha avanzado más allá del espacio de los ventrículos cerebrales. En este video, demostramos cómo inyectar colorante fluorescente en los ventrículos cerebrales de peces cebra en desarrollo.

Este método se utiliza para visualizar el espacio del ventrículo cerebral en contraste con el neuroepitelio circundante, y es extremadamente útil para determinar la forma del espacio ventricular así como la forma del tejido cerebral adyacente. Esta técnica nos permite comprender mejor el proceso de formación de los ventrículos cerebrales y la morfogénesis cerebral a lo largo del tiempo en el embrión vivo. Es una herramienta excelente para estudiar defectos en la formación de los ventrículos cerebrales y para la caracterización inicial de mutantes en la morfogénesis cerebral.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.