Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero

Este procedimiento comienza con la recepción de un cerebro perfundido, externalizado y crioprotegido con un 4% de PFA, que se ha enviado a los asociados de Neuroscience para su inclusión utilizando puntos de referencia de alineación incrustados en la matriz circundante. El cerebro se puede seccionar en el plano coronal para producir secciones en serie con el grosor deseado, que representarán toda la extensión anterior posterior del cerebro utilizando cestas y contenedores especializados. El inmunoprocesamiento por lotes se puede realizar para determinar el patrón de expresión espacial de una proteína en todo el cerebro.

Hola, soy la Dra. Shaheen Zur del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Facultad de Optometría de la Universidad de Montreal. Hola, soy el Dr. Mark Burke, también del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Hola, soy Dr.Mo Petto, director del Laboratorio de Neurociencia Visual de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal.

Hoy le mostraremos un procedimiento para la inmunotinción por lotes para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro de un mono completo. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los patrones de expresión de las proteínas diana en todo el cerebro y para comparar y contrastar la expresión de esas proteínas dentro del mismo cerebro. Así que comencemos.

Antes del procesamiento histológico, se obtiene un cerebro de primate, que se ha conservado mediante perfusión sistémica y posfijación y se ha crioprotegido con soluciones de sacarosa graduadas. En esta etapa, el cerebro se envía a los asociados de neurociencia para que lo integren y lo seccionen libremente utilizando su tecnología patentada. A su regreso, se observará que se colocan siete puntos de referencia de alineación en la matriz de inclusión para que las secciones puedan orientarse correctamente y realinearse una vez finalizado el procesamiento histológico.

Mientras se realiza el corte, se toman imágenes digitales que luego se pueden utilizar para la reconstrucción 3D de mapas anatómicos. Neuroscientist Associates procesa nuestro tejido para producir secciones coronales en serie de 50 micrómetros de espesor que flotan libremente en todo el cerebro. Una vez finalizado, podemos comenzar el procesamiento histológico de las secciones.

Cuando comenzamos el procesamiento histológico, normalmente tenemos que manejar alrededor de 140 secciones por anticuerpo o tinción. Aquí demostraremos la técnica con una muestra más pequeña de secciones tratadas con el anticuerpo SMI 32, que es un anticuerpo monoclonal contra proteínas de neurofilamentos no fosforiladas. A lo largo del procedimiento, se utilizan platos y cestas de tinción especializados, lo que permite procesar un gran número de secciones flotantes de forma simultánea y eficiente.

Esto asegura que la mancha resultante sea consistente en todas las secciones. El primer paso es incubar las secciones en una solución basada en PBS que contenga TRITTON X 100 y suero de caballo normal durante 60 minutos. Esto reducirá la unión inespecífica de las moléculas de anticuerpos que da lugar a la tinción de fondo.

A continuación, las secciones se incuban durante la noche. En una solución de anticuerpos SMI 32 basada en PBS, suplementada con tritton X 100 y suero de caballo normal al día siguiente, las secciones se lavan durante tres períodos de 10 minutos en solución de lavado y luego se incuban durante dos horas a temperatura ambiente. En una solución de anticuerpos secundarios Muse biotinilada basada en PBS que contiene Triton X 100 y suero de caballo normal.

Después de un conjunto de tres lavados adicionales de 10 minutos, las secciones se colocan en una solución de complejo de peroxidasa de rábano picante conjugado con biotina avadon durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, después de otra serie de lavados, las secciones se colocan en una reacción de D aminobencina durante 10 minutos, lo que produce una mancha marrón dentro de las neuronas inmunorreactivas. A continuación, se detiene la reacción retirando la cesta de tinción y sumergiendo las secciones en PBS.

Después de dos o tres, los enjuagues de cinco minutos en las secciones de PBS están listos para ser montados individualmente en portaobjetos de vidrio para comenzar el proceso de montaje utilizando una placa de Petri grande y pinceles de pintura muy suaves. Las secciones se levantan del contenedor intermedio de PBS y se montan individualmente en portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina. A continuación, las muestras se dejan secar al aire durante la noche en una campana extractora al día siguiente.

Las secciones se enjuagan sumergiéndolas en agua desionizada para lavar los cristales de sal que puedan quedar del proceso de montaje. A continuación, las correderas se deshidratan en pasos de etanol graduado, se limpian con xileno y se deslizan la cubierta con medio de montaje por montaje. En esta etapa, las correderas deben almacenarse durante aproximadamente una semana a 10 días en posición horizontal para permitir que el medio de montaje se endurezca.

Después de esto, los portaobjetos pueden almacenarse en una caja de portaobjetos o someterse a imágenes mediante microscopía. Este método produce un perfil de expresión completo de una proteína diana de interés en todo el cerebro de un mono. Aquí mostramos secciones coronales representativas que proporcionan una instantánea de FMRP, nueva expresión n y SMI 32.

En el mismo cerebro de mono. Acabamos de mostrarle cómo completar la tinción inmunológica por lotes para una proteína objetivo de interés en todo el cerebro. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de que todas las secciones se sometan a una agitación leve mientras se incuban en varias soluciones, y que en todo momento permanezcan completamente sumergidas.

Además, tómese su tiempo mientras monta las disecciones con vidrio y elimine la mayor cantidad posible de arrugas y pliegues sin dañar la integridad del tejido. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.