Aclarado óptico y etiquetado para microscopía de fluorescencia de lámina de luz en imágenes cerebrales humanas a gran escala
26 de enero de 2024
El presente protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la limpieza óptica rápida y simultánea, el marcaje multirredondo y la reconstrucción volumétrica en 3D de decenas de secciones cerebrales humanas postmortem mediante la combinación de la técnica de transformación tisular corta (S WITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) con imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz en un protocolo rutinario de alto rendimiento.
El cerebro humano es un órgano complejo que abarca diferentes habilidades. Para comprender su funcionalidad, es esencial construir sensores celulares detallados en todo el cerebro. Nuestro protocolo rutinario de alto rendimiento permite el análisis de la citoarquitectura 3D de áreas volumétricas del cerebro humano con resolución micrométrica, lo que permite su caracterización estructural.
La reconstrucción volumétrica de grandes áreas del cerebro humano presenta varios desafíos experimentales relacionados con las dimensiones masivas de las muestras cerebrales, la compleja composición biológica, las condiciones variables de fijación y almacenamiento postmortem, y las señales autofluorescentes de los pigmentos de tipo lipofuscina. Todo esto puede comprometer la eficiencia de limpieza óptica y la calidad demostrada. En comparación con otras técnicas de limpieza, el método de transformación tisular corta combinado con imágenes de microscopía de lámina de luz se puede utilizar para el procesamiento rápido y simultáneo de múltiples secciones del cerebro humano.
Esto da como resultado una reconstrucción cerebral en 3D con una resolución subcelular.
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo de alto rendimiento para la limpieza óptica simultánea, la marcación en múltiples rondas y la reconstrucción volumétrica tridimensional de secciones cerebrales humanas postmortem. Al integrar la técnica S WITCH - H 2 O 2 - Recuperación de Antígenos - 2,2'-tiodietanol (TDE) CORTA con microscopía de hoja luminiscente, la metodología permite una caracterización estructural detallada con resolución micrométrica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Histología
- Inmunohistoquímica
Antecedentes
- El cerebro humano es un órgano complejo que requiere un examen intrincado a través de diferentes escalas.
- Los desafíos incluyen el manejo de muestras cerebrales grandes y las señales autofluorescentes provenientes de pigmentos.
- El protocolo presentado aborda las deficiencias de las técnicas de clarificación existentes.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo optimizado para analizar la estructura del cerebro humano.
- Mejorar la eficiencia del aclaramiento óptico y la calidad de imagen de secciones de tejido cerebral.
- Permitir la reconstrucción tridimensional con alto nivel de detalle y fiabilidad.
Métodos Utilizados
- El estudio emplea microscopía de hoja de luz con fluorescencia.
- Se utiliza tejido cerebral humano como modelo biológico, con pasos detallados de seccionado y procesamiento descritos.
- Los pasos clave incluyen la inclusión de muestras en agarosa, el procesamiento con TDE y la inmunomarcación múltiple en varias rondas para diversos marcadores neuronales.
- Los tiempos y temperaturas de incubación se definen con precisión para garantizar condiciones óptimas de clarificación y obtención de imágenes.
Resultados principales
- El protocolo permite un aclaramiento óptico eficaz y una imagen de alta calidad de la materia gris y blanca.
- La tinción en múltiples rondas permite la visualización de poblaciones neuronales distintas en secciones cerebrales humanas.
- El método demuestra la capacidad de captar detalles subcelulares en reconstrucciones tridimensionales.
Conclusiones
- Este estudio establece un método para el análisis integral de la estructura cerebral con resolución de micrómetros.
- El enfoque resalta el potencial para avanzar en el entendimiento de la arquitectura cerebral y sus implicaciones para los estudios neuronales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La obtención de imágenes 3D de gran escala y alta resolución de tejido cerebral humano es fundamental para avanzar en la validación de dianas y en la comprensión mecanicista en la investigación y desarrollo farmacéutico neurológico&D. El protocolo SHORT, combinado con microscopía de hoja de luz por fluorescencia, permite una cartografía estructural rápida y multiplexada de subpoblaciones neuronales tanto en sustancia gris como en sustancia blanca. Esta capacidad respalda la confianza predictiva y la reducción de riesgos en las primeras etapas del descubrimiento y en los puntos de inflexión traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en Biofármacos R&D
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una interrogación detallada de la arquitectura neuronal y la cartografía de subpoblaciones para la validación de objetivos.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al revelar el contexto citoarquitectónico en tejido cerebral humano.
- Facilita la selección de carteras al proporcionar datos estructurales cuantitativos de alto contenido.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Prepara secciones de tejido ópticamente transparentes y multietiquetadas, adecuadas para flujos de trabajo cuantitativos de imágenes posteriores.
- Normaliza el procesamiento de muestras para obtener imágenes y análisis reproducibles y de alto rendimiento.
- Permite la detección multiplexada de marcadores neuronales, facilitando el desarrollo de ensayos robustos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los resultados de imágenes estructurales con la arquitectura cerebral humana relevante para la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el análisis directo de tejido humano.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo con datos integrales de citoarquitectura 3D.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
Este protocolo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir la obtención de imágenes cuantitativas de secciones cerebrales humanas a alto rendimiento para la validación de dianas y estudios mecanicistas.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante mapeo neuronal detallado.
- Selección: Proporciona muestras reproducibles y multiplexadas listas para imágenes, aptas para análisis cuantitativo.
- Análisis: Ofrece datos multicanal con resolución subcelular para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con trabajos preclínicos mediante la relevancia directa con tejido humano.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo escalable y estandarizado para su uso repetido en diversos programas neurobiológicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neurobiológicos.
- Valor operativo: Proporciona procesamiento e imagen estandarizados, escalables y reproducibles de tejidos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del desarrollo y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de los activos en neurofarmacología.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el procesamiento de tejidos, inmunomarcado y microscopía avanzada.
- Exige acceso a microscopía de hoja de luz con fluorescencia e infraestructura para imágenes multicanal.
- Necesita estandarización entre equipos en los protocolos de preparación de muestras y adquisición de imágenes.
- Puede ser necesaria una adaptación para distintas regiones cerebrales o condiciones del tejido.
- Los parámetros de manipulación e incubación de las muestras deben controlarse rigurosamente para obtener resultados óptimos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
