Ensayo para asociados a patógenos patrón molecular (PAMP)-Accionados Inmunidad (PTI) en las plantas

Hola, soy Suma TI del laboratorio de Greg Martin en el Voice Thompson Institute for Plant Research. Hoy le mostraremos un procedimiento para un ensayo basado en la muerte celular para la inmunidad desencadenada por PAM o PTI. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para buscar la participación de un gen en la PTI.

Así que comencemos. Comience el procedimiento cultivando Nicotiana ANA hasta que tengan aproximadamente siete semanas de edad. Cuatro o cinco días antes de comenzar.

El PAM desencadenó la inmunidad o el ensayo PTI. Recorte las plantas para eliminar todas las ramas axilares y flores. Intente quitar las ramas axilares poco después de que emerjan para que las plantas sean más manejables.

Después de preparar las plantas, proceda a cultivar las bacterias. Este procedimiento utiliza bacterias no patógenas para la inducción de la inmunidad de la planta antes de una segunda inoculación con bacterias de desafío, iniciando el crecimiento de todas las bacterias utilizadas en el ensayo. Al mismo tiempo, use tallos de glicerol congelados de la bacteria pseudomonas para cada tallo bacteriano de pseudomonas.

Extienda una pequeña cantidad de bacterias en el centro de una placa KBM que contenga el antibiótico apropiado e incube la placa a 30 grados centígrados durante aproximadamente 18 a 24 horas. Para la agrobacteria, use un plato fresco previamente preparado para iniciar un cultivo líquido en dos mililitros de lb. Crece durante la noche a 30 grados centígrados con agitación al día siguiente.

Agregue de 150 a 200 microlitros de KBM líquido a las placas de la bacteria pseudomonas. Esparce las bacterias por todo el plato. Usando un greter estéril.

Vuelva a colocar las placas en la incubadora durante otras 20 a 24 horas. Cuatro agrobacterias. Inicie un cultivo secundario en aproximadamente cinco a 10 mililitros de LB que contenga 20 micromolares de acetona.

Cultive el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados con agitación. Después de preparar las bacterias, proceda a preparar las plantas para el ensayo el día antes de realizar el ensayo PTI. Después de preparar las bacterias, traslade las plantas a una habitación de 22 a 24 grados centígrados con aproximadamente 35 a 40% de humedad relativa y luz constante.

A continuación, utiliza un rotulador negro grueso para marcar círculos en las hojas. Elija hojas bien expandidas y evite las hojas más viejas o las hojas que sean duras o gruesas al tacto. Evite marcar las partes inferiores de la hoja.

Los círculos tienen al menos 1,5 centímetros de diámetro y se pueden marcar de dos a cuatro círculos por hoja. Los círculos deben estar bien espaciados y preferiblemente no cruzar una vena grande. Comience el ensayo de PTI recolectando las bacterias utilizadas en la inducción de PTI.

Las especies de pseudomonas utilizadas deberían haber formado un césped bacteriano indicativo de un buen crecimiento. Coseche del plato raspándolos con un palo de madera largo estéril y vuelva a suspender en unos 20 a 25 mililitros de 10 milimolares. Solución de cloruro de magnesio para centrífuga de agrobacterias.

El cultivo para recoger las células y resus se suspende en unos 20 a 25 mililitros de cloruro de magnesio de 10 milimolares más 10 milimolares. MES pH 5.6, repita la centrifugación y nuevamente, resus Suspender en aproximadamente 20 a 25 mililitros de la solución de cloruro de magnesio más MES. Ahora que las pseudomonas inductoras y las bacterias agrobacterium se resuspenden.

Mida la densidad óptica de los tres cultivos a una longitud de onda de 600 nanómetros. Ajuste el SAO diluyendo las células con cloruro de magnesio para las pseudomonas y MES más cloruro de magnesio para la agrobacteria. Los valores finales de OD requeridos se encuentran en el protocolo escrito adjunto.

Un volumen total de 25 mililitros de cultivo bacteriano es suficiente para inocular entre 40 y 50 manchas. Ahora comience el ensayo infiltrando los inductores de PTI en los círculos premarcados de las hojas con una jeringa de un mililitro sin aguja. Anote el orden en que se infiltraron las plantas y el momento exacto en que se inició la infiltración después de la inducción.

Proceda a la inoculación de provocación varias horas después de la inoculación de inducción. Coseche las cepas bacterianas necesarias para la inoculación de desafío como se mostró anteriormente para las cepas de pseudomonas inductoras. Nuevamente, mida el OD y ajuste la concentración de los cultivos de acuerdo con el protocolo de GR adjunto.

Iniciar la inoculación de provocación siete horas después de la infiltración del inductor. Utilice las siguientes combinaciones de inductores retadores. Elija un punto en la periferia del primer círculo de inoculación como centro del segundo círculo de inoculación.

Realizar la infiltración de desafío en el mismo orden de plantas que el de la inducción. Si hay varios puntos en una hoja, asegúrese de que las infiltraciones no se superpongan. Por último, dilución seriada en placa de todos los cultivos utilizados en el ensayo en placas KBM o LB que contengan los antibióticos adecuados.

Dos días después de la inoculación de provocación se puede comenzar a evaluar la respuesta de PTI, dos días después de la inducción y las inoculaciones de provocación buscan la aparición de muerte celular debido a la inmunidad desencadenada por efectores o ETI en los puntos que fueron desafiados con PST, la muerte celular DC 3000 dentro del área superpuesta de infiltración indica una ruptura de PTI y debe puntuarse como un fenotipo positivo cuatro o cinco días después de la inducción y el desafío Las inoculaciones buscan la aparición de muerte celular debido a la enfermedad en los lugares que fueron desafiados con el mutante DC 3000 hop Q1 o PS de nuevo alto. Busque la ruptura de la PTI que está indicada por la muerte celular debido a la enfermedad en el área superpuesta de infiltración. Continúe observando las plantas hasta que aquellas que no están comprometidas para PTI comiencen a mostrar muerte celular en el área superpuesta de infiltración.

Las plantas silenciadas para FLS dos se ven comprometidas para PTI dos días después de la inoculación con la combinación de PFDC. La muerte celular se observa en el área superpuesta, lo que indica la descomposición de las plantas de control de PTI que no han sido silenciadas para ningún gen. También se les inoculó la combinación PFDC y se les examinó dos días después de realizar el ensayo, la muerte celular debido al desafío se observa fuera pero no dentro del área superpuesta debido a una respuesta normal de PTI.

Acabamos de mostrarle cómo realizar un ensayo basado en la muerte celular para la inmunidad desencadenada por Pant o PTI mientras realiza este procedimiento. Es importante recordar mantener las plantas en las condiciones ambientales que recomendamos. Los niveles más altos de humedad afectarían negativamente a las plantas y harían que el ensayo avanzara más rápidamente.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.