Name: Ensayo para asociados a patógenos patrón molecular (PAMP)-Accionados Inmunidad (PTI) en las plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprende a evaluar la inmunidad desencadenada por PAMP (PTI) en Nicotiana benthamiana mediante un ensayo de muerte celular. Este método permite investigar genes involucrados en respuestas inmunitarias vegetales.

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Damos las gracias a Hye Sook-Oh, Morello Joanne y Alan Collmer, Departamento de Patología Vegetal y Biología de las Plantas-Microbios, la Universidad de Cornell, valiosa para los debates. Damos las gracias a Jesse Munkvold comentarios sobre el artículo. El financiamiento fue proporcionado por el Programa Nacional de Ciencia Fundación Genoma Vegetal, el número de premios DBI-0605059 (GBM).

Parte 1: crecimiento de las plantas y el mantenimiento Plantas de Nicotiana benthamiana utilizado en el ensayo debe ser de 7 semanas de edad. Que se debe ajustar por lo menos 4-5 días antes de la prueba para eliminar todas las ramas axilares y flores. Es una buena idea para eliminar ramas axilares poco después de salir a fin de que las plantas sean más manejables. Parte 2: Cultivo bacteriano DIA 1: <ol><li> Placas o las culturas de todas las cepas utilizadas en el ensayo se inició al mismo tiempo. Para las especies de Pseudomonas. que incluyen dos inductores y 3 cepas de desafío, las bacterias en placas KBM racha que contienen los antibióticos apropiados de las existencias de glicerol congelado (Tabla 2). Una pequeña cantidad de bacterias debe ser esparcida en el centro de la placa. Incubar la placa a 30 ° C durante aproximadamente 18-24 horas. De Agrobacterium, iniciar un cultivo líquido en LB 2 ml de un plato fresco y crecer durante la noche a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> DIA 2: <ol start="2"><li> Por Pseudomonas, añadir 150-200 l de KBM líquido a las bacterias y los extendió sobre toda la placa con un esparcidor de vidrio estéril. Ponga la placa posterior en la incubadora y se deja crecer por otro 20-24 horas. Debe haber un césped bacteriano en la placa al día siguiente, lo que indica un buen crecimiento. De Agrobacterium, iniciar un cultivo secundario en alrededor de 50-10 ml de LB con 20 acetosiringona M y se deja crecer durante la noche a 20 horas a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> Parte 3: Plantas de Preparación para el ensayo DIA 2: <ol><li> Un día antes de la prueba de las plantas debe ser trasladado a una habitación a 22-24 ° C, la luz ~ 35-40% de humedad relativa y constante. </li><li> Marcar los círculos en las hojas que son al menos 1,5 cm de diámetro con un marcador negro grueso. De dos a cuatro círculos pueden ser marcados por hoja. Los círculos deben estar bien espaciados y, preferentemente, no cruzar una vena grande. Elegir bien amplió las hojas. Evite las hojas más viejas o las hojas que son difíciles o gruesa al tacto y evitar marcando los círculos en las partes bajas de la hoja. </li></ol> Círculos marcando un día antes de la prueba no es esencial para el protocolo. Sin embargo, se ahorra tiempo si hay un gran número de plantas que están siendo ensayadas, y hace más fácil para lograr una sincronización precisa entre la inducción de la PTI y las inoculaciones desafío. Parte 4: La inducción de la PTI DIA 3: <ol><li> Recoger las células de la placa en 10 mM de MgCl 2 para P. fluorescens y P. putida. De Agrobacterium, se centrifuga la cultura para recoger las células y resuspender en 10 mM de MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Repetir la centrifugación y se resuspenden en el MgCl2-MES solución. Medir la densidad óptica (DO) de las células a 600 nm. Ajuste la SAO a los valores finales requeridos como se describe en la Tabla 2. Pseudomonas debe ser finalmente resuspendido en 10 mM MgCl 2 y Agrobacterium en el MgCl2-MES solución. Un volumen total de 25 ml es suficiente para inocular alrededor de 40-50 puntos. </li><li> Infiltrarse en los inductores PTI en los círculos de pre-marcado en las hojas con una jeringa de 1 ml sin aguja. Anote el orden en que las plantas fueron infiltradas y el momento exacto en que la infiltración se inició. </li></ol> Parte 5: Desafío de la inoculación <ol><li> Prepare P. syringae pv. DC3000 tomate, Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 y $ pv tabaci. para el desafío, como se describe en el apartado 4.1 y la Tabla 2. </li><li> Siete horas después de la infiltración inductor, realizar la infiltración de desafío en el mismo orden de las plantas como la inducción se llevó a cabo. Por lo general, un punto en la periferia del círculo primera inoculación puede ser utilizado como el centro del círculo de la segunda inoculación. Si hay múltiples puntos en una hoja de continuación, asegúrese de que las infiltraciones no se superpongan. </li><li> Placa de diluciones seriadas de todos los cultivos utilizados para el ensayo en placas KBM o LB con los antibióticos apropiados para determinar el número exacto UFC. </li></ol> Parte 6: Puntaje para la descomposición del PTI Día 5: <ol><li> Busque la aparición de la muerte celular debido a la ETI en los lugares que fueron inoculados con Pst DC3000. La muerte celular en el interior del área de solapamiento de la infiltración indica el desglose de PTI y debe ser calificado como un fenotipo positivo. </li></ol> Día 7: <ol start="2"><li> Busque la aparición de la muerte celular debido a la enfermedad en los lugares que fueron inoculados con Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 o pv Ps. Tabaci </em&gt;. Puntuación de un fenotipo positivo de la misma manera como se describe en la parte 6.1. </li></ol> Cuando las plantas de control (que no debe verse comprometida por PTI) comienzan a mostrar la muerte celular en la zona de solapamiento de la infiltración, dejar de hacer nuevas observaciones. Parte 7: Los resultados representativos La figura 1 muestra el resultado de un ensayo cuando P. fluorescens fue utilizado como el inductor y Pst DC3000 como el desafío. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. P. fluorescens fue infiltrado en N. benthamiana hojas (círculo negro) para inducir la PTI y 7 horas más tarde, el acto fue impugnado con Pst DC3000 (círculo blanco). Plantas silenciadas por FLS2 mostró un desglose de PTI en la región donde P. fluorescens fue infiltrado (A), como se ve por la muerte celular. Las plantas de control que no fueron silenciados no mostró la muerte celular en la zona de solapamiento debido a la inducción de la PTI (B). Las flechas rojas indican la falta de presencia o de la muerte celular en el área de superposición de la infiltración. Las fotografías fueron tomadas dos días después de la infiltración. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <table border="1"><tbody><tr><td> PTI inductor </td><td> Provocando la muerte celular-desafío </td><td> La naturaleza de la muerte celular </td><td> Código </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv tomate (Pst). DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> Pf / DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> ETI </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 6 </td><td> Enfermedad </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> Enfermedad </td><td> Agro / PTab </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Combinaciones de inducir la muerte celular PTI y que suscitan los microbios utilizados en el ensayo de la muerte celular por PTI. <table border="1"><tbody><tr><td> Cepa bacteriana </td><td> Selección del medio </td><td> OD final utilizada en el experimento </td><td> Correspondiente UFC / ml </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM ampicilina (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM ampicilina (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB con rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0.02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 hopQ1 Δ-1 </td><td> KBM rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 veces la dilución de 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> KBM rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 veces la dilución de 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Las condiciones de cultivo y los niveles de inóculo utilizado en el ensayo. El OD y los correspondientes niveles UFC pueden variar entre diferentes marcas de espectrofotómetros.

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

Ensayo de la muerte de la célula-basado puede ser utilizada para determinar la participación de un gen en el PTI. Por ejemplo, la pérdida de función de mutantes de un gen de interés se puede probar mediante este ensayo. De las cuatro combinaciones de inductor e inoculaciones desafío en la Tabla 1, es posible que sólo una combinación puede resultar en un fenotipo en el fondo de la planta. Hemos observado que las plantas silenciadas por FLS2 muestran un desglose del PTI en el Pf / DC y Pf/Q1-1 combinaciones de inductor e inoculaciones desafío (Tabla 1). Es esencial que las condiciones ambientales para el ensayo son lo más cercano posible a los descritos en la parte 3.1. La baja humedad provoca la muerte celular de proceder con demasiada rapidez, haciendo que el ensayo de difícil calificación. Si las condiciones descritas en el protocolo de no trabajar en su laboratorio, y luego tratar de alterar el nivel de inductor o inoculación de desafío. Otro parámetro que se puede modificar es el intervalo de tiempo entre la inducción y la provocación, aunque se ha encontrado que más cortos intervalos de tiempo causó que el ensayo se descomponen muy rápidamente en las plantas de control. Le recomendamos que por lo menos 4-5 plantas a prueba en un experimento y un fenotipo positivo se debe repetir por lo menos en experimentos independientes 3-4.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Preparar como solución stock 1 M, ajustar el pH y esterilizar por filtración. Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV/Vis para ciencias de la vida</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo para asociados a patógenos patrón molecular (pamp)-accionados inmunidad (pti) en las plantas

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

Para percibir los patógenos potenciales en su entorno, las plantas utilizan receptores de reconocimiento de patrones (RRP) presentes en su membrana plasmática. PRR reconoce conserva las características microbianas llamado patógeno patrones moleculares asociados (PAMP) y esto lleva a la detección de PAMP disparado por la inmunidad (PTI), lo que efectivamente previene la colonización de los tejidos de la planta por no patógenos 1,2. El sistema más estudiado bien en PTI es la vía 3 FLS2-dependiente. FLS2 reconoce la flg22 PAMP que es un componente de la flagelina bacteriana. Patógenos éxito poseen factores de virulencia o efectores que pueden suprimir la PTI y permitir que el patógeno que causa la enfermedad 1. Algunas plantas, a su vez poseen los genes de resistencia que detectan los efectores o su actividad, lo que lleva a efectores activados por la inmunidad (ETI) 2. Se describe una celda de la muerte de ensayo basado en la PTI modificado a partir de Oh y Collmer 4. El ensayo fue estandarizado en el N. benthamiana, que se está utilizando cada vez más como un sistema modelo para el estudio de las interacciones planta-patógeno 5. PTI es inducida por la infiltración de una cepa no patógena de bacterias en las hojas. Siete horas después, una cepa bacteriana que causa la enfermedad o bien que se activa la ETI se infiltra en una zona de solapamiento de la zona de infiltración original. PTI inducida por la primera infiltración es capaz de retrasar o prevenir la aparición de la muerte celular debido a la infiltración segundo desafío. Por el contrario, la aparición de la muerte celular en la zona de solapamiento de la inoculación indica el desglose de PTI. Cuatro combinaciones diferentes de los inductores del PTI y las inoculaciones desafío fueron estandarizadas (Tabla 1). El ensayo fue probado en no callar N. benthamiana plantas que sirvieron de control y las plantas de silencio para FLS2 que se prevé que se compromete en su capacidad de desarrollar PTI.

Una célula de la muerte de ensayo basado en la PTI en plantas de Nicotiana benthamiana se describe.

Ensayo para asociados a patógenos patrón molecular (PAMP)-Accionados Inmunidad (PTI) en las plantas

Para percibir patógenos potenciales en su entorno, las plantas utilizan receptores de reconocimiento de patrones (PRR), presentes en sus membranas plasmáticas. Los PRR reconocen...

Hola, soy Suma TI del laboratorio de Greg Martin en el Instituto de Investigación de Plantas Voice Thompson. Hoy les mostraremos un procedimiento para un ensayo basado en muerte celular para la inmunidad inducida por PAM o PTI. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar la participación de un gen en la PTI.Así que comencemos. Inicie el procedimiento cultivando Nicotiana ANA hasta que tengan aproximadamente siete semanas de edad. Cuatro a cinco días antes de comenzar.El ensayo de inmunidad inducida por PAM o PTI. Recorte las plantas para eliminar todas las ramas axilares y flores. Intente eliminar las ramas axilares poco después de que emergen para hacer que las plantas sean más manejables.Después de preparar las plantas, proceda a cultivar las bacterias. Este procedimiento utiliza bacterias no patógenas para inducir la inmunidad vegetal antes de una segunda inoculación con bacterias desafío; inicie el crecimiento de todas las bacterias utilizadas en el ensayo. Al mismo tiempo, use los cultivos bacterianos de glicerol congelados de Pseudomonas para cada cultivo bacteriano de Pseudomonas.Extienda una pequeña cantidad de bacterias en el centro de una placa KBM que contenga el antibiótico adecuado e incube la placa a 30 grados Celsius durante aproximadamente 18 a 24 horas. Para el agrobacterium, utilice una placa fresca previamente preparada para iniciar un cultivo líquido en dos mililitros de lb. Incube durante la noche a 30 grados Celsius con agitación al día siguiente.Agregue de 150 a 200 microlitros de medio líquido KBM a las placas de las bacterias Pseudomonas. Extienda las bacterias por toda la placa. Utilizando un espátula estéril.Coloque las placas nuevamente en el incubador durante otras 20 a 24 horas. Cuatro agrobacterium. Inicie un cultivo secundario en aproximadamente cinco a 10 mililitros de LB que contenga 20 micromolar de acetona.Cultive la muestra durante la noche a 30 grados Celsius con agitación. Después de preparar las bacterias, proceda a preparar las plantas para el ensayo el día anterior a la realización del ensayo de PTI. Tras preparar las bacterias, traslade las plantas a una habitación con una temperatura de 22 a 24 grados Celsius, una humedad relativa de aproximadamente 35 a 40% y luz constante.A continuación, utilice un rotulador negro grueso para marcar círculos en las hojas. Elija hojas bien expandidas y evite las hojas más viejas o aquellas que sean duras o gruesas al tacto. Evite marcar las porciones inferiores de la hoja.Los círculos tienen un diámetro de al menos 1,5 centímetros y se pueden marcar de dos a cuatro círculos por hoja. Los círculos deben estar bien espaciados y, preferiblemente, no cruzar una vena grande. Comience el ensayo de PTI recolectando las bacterias utilizadas en la inducción de PTI.Las especies de Pseudomonas utilizadas deberían haber formado un césped bacteriano indicativo de un buen crecimiento. Recójanse del plato raspando con un palillo estéril largo y resuspéndanse en aproximadamente 20 a 25 mililitros de solución de cloruro de magnesio 10 milimolar para la centrifugación de Agrobacterium.La cultivo para recoger las células y resuspender en aproximadamente 20 a 25 mililitros de cloruro de magnesio 10 milimolar más 10 milimolar de MES, pH 5,6. Repita la centrifugación y, nuevamente, resuspenda en aproximadamente 20 a 25 mililitros de la solución de cloruro de magnesio más MES. Ahora que las bacterias inductoras de Pseudomonas y Agrobacterium están resuspendidas.Mida la densidad óptica de las tres culturas a una longitud de onda de 600 nanómetros. Ajuste las ODS diluyendo las células con cloruro de magnesio para la pseudomonas y MES más cloruro de magnesio para la agrobacterium. Los valores finales requeridos de OD se encuentran en el protocolo escrito adjunto.Un volumen total de 25 mililitros de cultivo bacteriano es suficiente para inocular aproximadamente entre 40 y 50 puntos. Comience ahora el ensayo infiltrando los inductores de PTI en los círculos previamente marcados sobre las hojas, utilizando una jeringa de un mililitro sin aguja. Anote el orden en que se infiltraron las plantas y la hora exacta en que se inició la infiltración tras la inducción.Proceda a la inoculación de desafío varias horas después de la inoculación inductora. Recolecte las cepas bacterianas necesarias para la inoculación de desafío como se mostró previamente para las cepas de Pseudomonas inductoras. Nuevamente, mida la DO y ajuste la concentración de los cultivos según el protocolo GR adjunto.Inicie la inoculación de desafío siete horas después de la infiltración del inductor. Utilice las siguientes combinaciones de inductor y desafiador. Elija un punto en la periferia del primer círculo de inoculación como centro del segundo círculo de inoculación.Realice la infiltración de desafío en el mismo orden de plantas que el de la inducción. Si hay múltiples puntos en una hoja, asegúrese de que las infiltraciones no se superpongan. Finalmente, siembre por dilución en serie todas las culturas utilizadas en el ensayo en placas de KBM o LB que contengan los antibióticos adecuados.Dos días después de la inoculación de desafío, se puede comenzar a evaluar la respuesta de inmunidad inducida por patógenos (PTI). Dos días después de las inoculaciones de inducción y desafío, observe la aparición de muerte celular debida a la inmunidad activada por efectores (ETI) en los puntos que fueron desafiados con PST DC 3000. La muerte celular dentro del área de superposición de la infiltración indica una ruptura de la PTI y debe calificarse como un fenotipo positivo. De cuatro a cinco días después de las inoculaciones de inducción y desafío, observe la aparición de muerte celular debida a la enfermedad en los puntos que fueron desafiados con la cepa mutante DC 3000 hop Q1 o PS back high nuevamente. Busque la ruptura de la PTI, indicada por muerte celular debida a la enfermedad en el área de superposición de la infiltración. Continúe observando las plantas hasta que aquellas que no presentan defectos en la PTI comiencen a mostrar muerte celular en el área de superposición de la infiltración.Las plantas silenciadas para FLS2 presentan un PTI comprometido dos días después de la inoculación con la combinación PFDC. Se observa muerte celular en el área de superposición, lo que indica la ruptura del PTI en plantas control que no han sido silenciadas para ningún gen. También se inoculó con la combinación PFDC y se examinó dos días después de realizar el ensayo; la muerte celular debida al desafío se observa fuera, pero no dentro, del área de superposición debido a una respuesta normal de PTI.Acabamos de mostrarle cómo realizar un ensayo basado en la muerte celular para la inmunidad inducida por patógenos o PTI durante este procedimiento. Es importante recordar mantener las plantas en las condiciones ambientales que recomendamos. Niveles más altos de humedad afectarían negativamente a las plantas y harían que el ensayo progresara más rápidamente.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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