Ensayo para asociados a patógenos patrón molecular (PAMP)-Accionados Inmunidad (PTI) en las plantas

Hola, soy Suma TI del laboratorio de Greg Martin en el Instituto de Investigación de Plantas Voice Thompson. Hoy les mostraremos un procedimiento para un ensayo basado en muerte celular para la inmunidad inducida por PAM o PTI. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar la participación de un gen en la PTI.

Así que comencemos. Inicie el procedimiento cultivando Nicotiana ANA hasta que tengan aproximadamente siete semanas de edad. Cuatro a cinco días antes de comenzar.

El ensayo de inmunidad inducida por PAM o PTI. Recorte las plantas para eliminar todas las ramas axilares y flores. Intente eliminar las ramas axilares poco después de que emergen para hacer que las plantas sean más manejables.

Después de preparar las plantas, proceda a cultivar las bacterias. Este procedimiento utiliza bacterias no patógenas para inducir la inmunidad vegetal antes de una segunda inoculación con bacterias desafío; inicie el crecimiento de todas las bacterias utilizadas en el ensayo. Al mismo tiempo, use los cultivos bacterianos de glicerol congelados de Pseudomonas para cada cultivo bacteriano de Pseudomonas.

Extienda una pequeña cantidad de bacterias en el centro de una placa KBM que contenga el antibiótico adecuado e incube la placa a 30 grados Celsius durante aproximadamente 18 a 24 horas. Para el agrobacterium, utilice una placa fresca previamente preparada para iniciar un cultivo líquido en dos mililitros de lb. Incube durante la noche a 30 grados Celsius con agitación al día siguiente.

Agregue de 150 a 200 microlitros de medio líquido KBM a las placas de las bacterias Pseudomonas. Extienda las bacterias por toda la placa. Utilizando un espátula estéril.

Coloque las placas nuevamente en el incubador durante otras 20 a 24 horas. Cuatro agrobacterium. Inicie un cultivo secundario en aproximadamente cinco a 10 mililitros de LB que contenga 20 micromolar de acetona.

Cultive la muestra durante la noche a 30 grados Celsius con agitación. Después de preparar las bacterias, proceda a preparar las plantas para el ensayo el día anterior a la realización del ensayo de PTI. Tras preparar las bacterias, traslade las plantas a una habitación con una temperatura de 22 a 24 grados Celsius, una humedad relativa de aproximadamente 35 a 40% y luz constante.

A continuación, utilice un rotulador negro grueso para marcar círculos en las hojas. Elija hojas bien expandidas y evite las hojas más viejas o aquellas que sean duras o gruesas al tacto. Evite marcar las porciones inferiores de la hoja.

Los círculos tienen un diámetro de al menos 1,5 centímetros y se pueden marcar de dos a cuatro círculos por hoja. Los círculos deben estar bien espaciados y, preferiblemente, no cruzar una vena grande. Comience el ensayo de PTI recolectando las bacterias utilizadas en la inducción de PTI.

Las especies de Pseudomonas utilizadas deberían haber formado un césped bacteriano indicativo de un buen crecimiento. Recójanse del plato raspando con un palillo estéril largo y resuspéndanse en aproximadamente 20 a 25 mililitros de solución de cloruro de magnesio 10 milimolar para la centrifugación de Agrobacterium.

La cultivo para recoger las células y resuspender en aproximadamente 20 a 25 mililitros de cloruro de magnesio 10 milimolar más 10 milimolar de MES, pH 5,6. Repita la centrifugación y, nuevamente, resuspenda en aproximadamente 20 a 25 mililitros de la solución de cloruro de magnesio más MES. Ahora que las bacterias inductoras de Pseudomonas y Agrobacterium están resuspendidas.

Mida la densidad óptica de las tres culturas a una longitud de onda de 600 nanómetros. Ajuste las ODS diluyendo las células con cloruro de magnesio para la pseudomonas y MES más cloruro de magnesio para la agrobacterium. Los valores finales requeridos de OD se encuentran en el protocolo escrito adjunto.

Un volumen total de 25 mililitros de cultivo bacteriano es suficiente para inocular aproximadamente entre 40 y 50 puntos. Comience ahora el ensayo infiltrando los inductores de PTI en los círculos previamente marcados sobre las hojas, utilizando una jeringa de un mililitro sin aguja. Anote el orden en que se infiltraron las plantas y la hora exacta en que se inició la infiltración tras la inducción.

Proceda a la inoculación de desafío varias horas después de la inoculación inductora. Recolecte las cepas bacterianas necesarias para la inoculación de desafío como se mostró previamente para las cepas de Pseudomonas inductoras. Nuevamente, mida la DO y ajuste la concentración de los cultivos según el protocolo GR adjunto.

Inicie la inoculación de desafío siete horas después de la infiltración del inductor. Utilice las siguientes combinaciones de inductor y desafiador. Elija un punto en la periferia del primer círculo de inoculación como centro del segundo círculo de inoculación.

Realice la infiltración de desafío en el mismo orden de plantas que el de la inducción. Si hay múltiples puntos en una hoja, asegúrese de que las infiltraciones no se superpongan. Finalmente, siembre por dilución en serie todas las culturas utilizadas en el ensayo en placas de KBM o LB que contengan los antibióticos adecuados.

Dos días después de la inoculación de desafío, se puede comenzar a evaluar la respuesta de inmunidad inducida por patógenos (PTI). Dos días después de las inoculaciones de inducción y desafío, observe la aparición de muerte celular debida a la inmunidad activada por efectores (ETI) en los puntos que fueron desafiados con PST DC 3000. La muerte celular dentro del área de superposición de la infiltración indica una ruptura de la PTI y debe calificarse como un fenotipo positivo. De cuatro a cinco días después de las inoculaciones de inducción y desafío, observe la aparición de muerte celular debida a la enfermedad en los puntos que fueron desafiados con la cepa mutante DC 3000 hop Q1 o PS back high nuevamente. Busque la ruptura de la PTI, indicada por muerte celular debida a la enfermedad en el área de superposición de la infiltración. Continúe observando las plantas hasta que aquellas que no presentan defectos en la PTI comiencen a mostrar muerte celular en el área de superposición de la infiltración.

Las plantas silenciadas para FLS2 presentan un PTI comprometido dos días después de la inoculación con la combinación PFDC. Se observa muerte celular en el área de superposición, lo que indica la ruptura del PTI en plantas control que no han sido silenciadas para ningún gen. También se inoculó con la combinación PFDC y se examinó dos días después de realizar el ensayo; la muerte celular debida al desafío se observa fuera, pero no dentro, del área de superposición debido a una respuesta normal de PTI.

Acabamos de mostrarle cómo realizar un ensayo basado en la muerte celular para la inmunidad inducida por patógenos o PTI durante este procedimiento. Es importante recordar mantener las plantas en las condiciones ambientales que recomendamos. Niveles más altos de humedad afectarían negativamente a las plantas y harían que el ensayo progresara más rápidamente.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.