Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

El objetivo general de este procedimiento es detectar cuantitativamente las interacciones proteína-proteína en un sistema de expresión transitoria. Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de transacción de señales cuaquánicas, como cómo monitorear cuantitativamente las direcciones de nuestras proteínas después de un tratamiento químico o ambiental. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un luminómetro o una cámara CCD para detectar la actividad lucifera, que representa la intensidad de la dirección de la proteína, por lo que los resultados son más precisos.

Para comenzar este procedimiento, agregue un mililitro de una solución que contenga hipoclorito de sodio al cinco por ciento y tritón x cien coma cero a un tubo de microcentrífuga de un coma cinco mililitros que contenga semillas. Deje reposar la solución durante cinco minutos para esterilizar las semillas. Luego, lave las semillas con agua estéril cinco veces.

Suspender las semillas lavadas en doscientos microlitros de agua estéril. Con puntas finas, coloque con cuidado las semillas individuales sobre la superficie del medio de agar MS plateado. Almacene los platos a cuatro grados centígrados durante tres días para sincronizar la germinación.

Después de esto, mantenga las placas medianas en condiciones normales de crecimiento durante diez días. Transfiera las plántulas en germinación al suelo, asegurándose de no dañar las raíces. Cubra la bandeja con una cubierta de plástico transparente durante la noche para mantener la humedad.

Cultive las plantas en una sala de crecimiento controlado durante siete semanas, cuando estarán listas para la infiltración de agrobacterium tumefaciens. Para empezar, entregue ciento cincuenta nanogramos de plásmidos en la cepa de células competentes a-tumefaciens GV3101. Colocar los tubos que contienen el cultivo de a-tumefaciens en un agitador e incubar durante cuatro horas.

Con una varilla de vidrio, transfiera el cultivo de los tubos a los medios LB. Cultivo de a-tumefaciens y medio de agar LB a 28 grados centígrados durante cuatro días. A continuación, prepárese para inocular una sola colonia de a-tumefaciens de cada placa en su propio tubo que contiene tres mililitros de medio líquido LB.

Agitar a 280 RBM a 28 grados centígrados durante 24 horas para propagar el cultivo. Luego, transfiera 75 microlitros del cultivo bacteriano a 15 mililitros de medio líquido LB fresco que contenga 15 microgramos por mililitro de kanamicina y 50 microgramos por mililitro de rifampicina. Cultive las bacterias a 220 RPM a 30 grados Celsius durante aproximadamente 8 horas hasta que OD600 esté entre 0,5 a 1.

Después de esto, transfiera el cultivo a tubos de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a 4000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet en 15 mililitros de solución de transformación.

Centrifugar a 4000 veces la gravedad y 4 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, repita el paso de suspensión y centrifugación una vez más. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet en 5 mililitros de solución de transformación.

Deje reposar el palet resuspendido durante dos horas a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. A continuación, añada la solución de transformación al OD600 que sea 0,5 o combine dos muestras con el mismo volumen para probar las interacciones de proteínas emparejadas. Con una aguja de jeringa de un mililitro, infiltre las células suspendidas en la cuarta a la séptima hoja.

Después de esto, cubra inmediatamente las plantas con una cubierta de plástico negro durante 12 horas. En primer lugar, las plantas deben estar muy sanas para garantizar el éxito. En segundo lugar, asegúrese de no dañar ninguna hoja durante el proceso de infiltración.

Mantenga la bandeja en oscuridad durante 12 horas. Luego, cultive las plantas en condiciones normales durante 2 a 4 días antes de detectar la actividad de la luciferasa. Para comenzar el método de diagnóstico por imágenes, separe una hoja infiltrada.

Coloque todo el folleto en una placa de medio de agar MS. Con una botella rociadora de 50 mililitros, rocíe el tampón de trabajo luciferón en el lado adaxial de las hojas. Luego, manténgalo en la oscuridad durante 5 minutos para apagar la autofluorescencia de la clorofila.

Utilice un aparato de imagen CCD refrigerado por luz más baja enfriado a menos 30 grados Celsius para capturar imágenes con un tiempo de exposición lleno de luz de 50 milisegundos y un tiempo de detección de luminiscencia de 1 minuto. Después de esto, corte los fragmentos de hojas del área de infiltración de las hojas de N-benthamiana. Sumerja los fragmentos en 100 microlitros de agua desionizada en los pocillos de placa blanca de 96 pocillos.

Agregue diez microlitros de tampón de trabajo luciferón. Deje reposar el plato 5 minutos. A continuación, realice cualquier tratamiento específico que desee para estudiar la dinámica de la interacción de las proteínas y mida la luminiscencia directamente con un luminómetro comercial.

Aquí se muestra la demostración de la actividad lucifera para representar las interacciones de COP 1 SPA 1. La actividad lucifera, que se detecta por luminiscencia, es fotografiada por una cámara CCD. Se ha observado que las interacciones COP 1 SPA 1 dan lugar a una mutación del cobre de la luciferasa funcional.

A continuación, se determina la actividad de la luciferasa bajo el tratamiento con Jazmín 8 a lo largo del tiempo. Se observa que las interacciones de COP 1 SPA 1 representadas por la actividad de la luciferasa disminuyen gradualmente en la oscuridad. El tratamiento con Jasmine 8 reduce aún más estas interacciones.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en 1 semana, después de que las plantas estén listas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las plantas sanas. Infiltre las hojas con cuidado e incluya los controles correctamente.

Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de las transacciones de señales exploren la dinámica de la interacción proteína-proteína de una manera rápida. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar plantas de tabaco, infiltrar agrobacterias en las hojas de tabaco y detectar actividades luciferas.