Name: Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a detectar cuantitativamente interacciones proteína-proteína en hojas de Nicotiana benthamiana mediante ensayo de luciferasa. Este método rápido utiliza luminometría para estudiar dinámicas de señalización celular.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Jiangsu (BK20140919), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31470375), el proyecto de Lan Qing y prioridad académica programa de desarrollo de Jiangsu instituciones de educación superior.

1. preparación de plantas (8 semanas)
<ol><li>Poner 50 semillas de Nicotiana benthamiana en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 1 mL de 5% NaClO y solución al 0,1% Tritón X-100 (V/V) y licencia para 5 min esterilizar las semillas.</li>
	<li>Enjuagar las semillas con agua estéril 5 veces y suspender las semillas en 200 μL de agua estéril.</li>
	<li>Cuidadosamente lugar semillas individuales sobre la superficie del medio de MS-agar (1 L: 1 x sales de Murashige y Skoog, sacarosa 10 g, pH 5.8 (KOH), agar al 1%) con puntas finas y placas de medio de almacén en 4 ° C por 3 días sincronizar la germinación. Nota: Para evitar la contaminación del microbio, realice este paso en una mesa de trabajo limpia. No es necesario agitar el tubo durante la esterilización.</li>
	<li>Colocar placas de medio bajo condiciones de crecimiento normal (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 blanco intensidad de la luz) durante 10 días y entonces transfiera las plántulas germinadas en el suelo. Nota: Asegúrese de que insertar las raíces de las plántulas en suelo y no dañar las raíces. Cubrir la bandeja con una cubierta de plástico transparente durante la noche para mantener la humedad.</li>
	<li>Crecer las plantas en una habitación de crecimiento controlado a una humedad de ciclo y el 70% de 16 h a 8 h luz/oscuridad. 7 semanas de edad las plantas de N. benthamiana están listas para Agrobacteriumtumefaciens de infiltración (figura 1A). Nota: Plantas de agua y control de plagas según sea necesario para mantener las plantas sanas.</li>
</ol>2. transitoria expresión en hojas de N. Benthamiana (7-10 días)
<ol><li>Entregan 150 ng de plásmidos (plásmido control pEGAD-HA-LUC y vacía vector plásmido construido para LCI de ensayo, en este caso hemos utilizado pCAMBIA1300-Nluc y pCAMBIA1300 Cluc para la construcción de plásmidos) en a. tumefaciens célula competente cepa GV3101 con un método de electroporación estándar.</li>
	<li>Cultura a. tumefaciens en Luria-Bertani (LB) agar medio (1 L: 10 g NaCl, extracto de levadura 5 g, 10 g de triptona, agar 1,5%) que contienen 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina a 28 ° C durante 4 días. Nota: La elección de los antibióticos depende del vector y la cepa de a. tumefaciens empleada.</li>
	<li>Inocular una sola Colonia de a. tumefaciens de cada placa en 3 mL de medio líquido LB que contienen 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina y agitar a 220 rpm a 28 ° C durante 24 h propagar el cultivo celular.</li>
	<li>Transferencia de 75 μl de cultivo bacteriano en 15 mL LB líquido medio fresco que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina, diluyéndolo en un factor de 200. Cultura de las bacterias a 220 rpm a 30 ° C por cerca de 8 horas, hasta OD600 es entre 0.5 a 1.0.</li>
	<li>Transferir el cultivo líquido de a. tumefaciens en tubos de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 4.000 x g y 4 ° C por 15 minutos, descartar el sobrenadante y suspender la pastilla en 15 mL de solución de transformación para lavar el pellet.</li>
	<li>Girar el tubo a 4.000 x g y 4 ° C por 15 min y descarte el sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez más.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 5 mL de solución de transformación y mantener durante 2 h a temperatura ambiente. Ajuste la densidad de a. tumefaciens pelotilla células con solución de transformación hasta que la concentración final de OD600 es 0,5, o mezcla de dos muestras con igual volumen de interacciones de proteínas apareadas prueba.</li>
	<li>Infiltrar las células suspendidas en el 4th a 7 hojas deth con una jeringa sin aguja 1 mL (figura 1B-C). Después de la infiltración, cubrir las plantas inmediatamente con una cubierta de plástico negro y coloque la bandeja en la oscuridad durante 12 h. Después de eso, crecen las plantas como de costumbre para 2 a 4 días antes de detectar actividades LUC. Nota: Elija hojas sanas de tamaño similar. La infiltración de cuatro zonas diferentes en una hoja es fina.</li>
</ol>3. detección de actividad de luciferasa (un día)
Nota: Hay dos formas de controlar la actividad de luciferasa. Uno se basa en la proyección de imagen, y el otro es para medir cuantitativamente la actividad de luciferasa.
<ol><li>
Método de proyección de imagen
	<ol>
<li>Separar una hoja infiltrada y el folleto entero en medio MS-agar.</li>
		<li>Tampón sobre la superficie adaxial de la hoja con un atomizador de 50 mL en spray luciferin trabajo. Mantener los materiales en la oscuridad durante 5 minutos apagar el auto fluorescencia de la clorofila.</li>
		<li>Utilizar un CCD refrigerado por poca luz imagen aparato (enfriado a-30 ° C) para capturar imágenes (figura 2). El tiempo de exposición presentado por luz es 50 ms, y tiempo de detección de luminiscencia es de 1 minuto. Nota: Ajuste los parámetros según el manual de la máquina. Temperaturas más bajas mejorarán la relación señal-ruido para mejorar la calidad de la imagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Por otra parte, medir luminiscencia directamente con un luminómetro comercial.<ol>
<li>Recortar fragmentos de la hoja (aproximadamente 0,25 cm2) de la zona de infiltración de las hojas de N. benthamiana y cuidadosamente sumerja el disco de hoja en 100 μl de agua desionizada en una placa de 96 pocillos blanca (figura 3).</li>
		<li>Añadir 10 μl de tampón de trabajo luciferin y dejar durante 5 minutos. Realizar tratamientos específicos para estudiar la dinámica de interacción de la proteína. Nota: Detectar la luminiscencia con un luminómetro en diferentes puntos temporales para obtener la dinámica actividad de luciferasa, que representan la cinética de las interacciones proteína-proteína bajo cierto tratamiento. Este método tiene ventajas para las pruebas de un gran número de pares de proteínas simultáneamente. Para aquellos sin un luminómetro comercial, examinar la concentración de proteína luciferase por western blot, por lo tanto se refieren a la posible actividad LUC. Si la luz no es necesaria, sólo mantener la placa en el luminómetro y medir luminiscencia en diferentes puntos temporales. De lo contrario, mueva la placa en una cámara de crecimiento durante el espacio de detección. Para obtener resultados estadísticamente significativos, utilizar al menos tres réplicas biológicas. Aunque varían las actividades LUC de zonas de infiltración diferentes, sus patrones de cambio son constantes después de la normalización.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí es simple y reproducible para el estudio en vivo las interacciones proteína-proteína y particularmente conveniente para detectar la dinámica de interacción de la proteína bajo tratamiento exógeno. El paso clave en este ensayo es infiltración de N. benthamiana . Para asegurar el éxito de infiltración, las plantas deben ser muy saludables. Otro factor crítico es cuando verificar actividad de luciferasa después de la infiltración. Existe una respuesta correcta para esta pregunta....

Con el fin de coordinar crecimiento con su entorno, las plantas han evolucionado elegante vías de señalización para sentido, transducir y responder a señales de señalización. Como los corredores en una carrera de relevos, las proteínas son necesarias en transduction de la señal de planta. Ha sido ampliamente reconocido que la interacción proteína-proteína (PPI) desempeña un papel importante para la comunicación celular. Degradación, acetilación y fosforilación de la proteína son todas dependen de la interacción física entre una proteína diana y sus enzimas de modificación. Por ejemplo, Jasmonate ZIM-dominio proteína (JAZ) familia proteínas interactúan con el factor de transcripción MYC2 y suprimen su actividad transcripcional1,2. Dada la importancia de PPI, proteína a gran escala han sido interactomes en las plantas exploradas recientemente3,4,5. Estos resultados del interactoma más revelan la compleja red de regulación que coordina diversas funciones celulares.
Hay algunos enfoques establecidos para el seguimiento PPI. La levadura dos híbridos (Y2H) es el método más ampliamente utilizado para la detección de PPI. Y2H es fácil de realizar y adecuado para una prueba rápida examinar las interacciones entre proteínas. Y2H es también ampliamente utilizado para la detección de socios desconocidos de la interacción de la proteína de interés específico. Sin embargo, porque Y2H se realiza enteramente en la levadura, no puede reflejar la situación real en la planta las células y aporta altos falsos positivos. Otra estrategia similar es el análisis pull-down. En general, dos proteínas son expresadas y purificadas de células de Escherichia coli mezcladas e inmovilizadas para la detección de las interacciones entre proteínas. Aunque este método no es desperdiciador de tiempo, que no puede obtener en vivo resultados de interacción ya sea. Para propósitos de interacción en vivo , co-inmunoprecipitación (co-IP) es el ensayo más popular, que requiere de anticuerpos de alta calidad para immunoprecipitate el proteína de interés y no se puede excluir la posibilidad de IBP indirectas. Por otra parte, debido a los complicados procedimientos experimentales en co-IP, los resultados generalmente varían con cada experiencia.
Ensayos de reconstitución de reportero basado en avanzarán enormemente la detección de en vivo PPI. Estos métodos incluyen la fluorescencia de resonancia energética transferencia (traste)6, bimolecular de la fluorescencia complementación (centro)7y la complementación de la luciferasa de luciérnaga (LCI) ensayo8la proyección de imagen. Aunque estos tres enfoques son mejor que co-IP directa en vivo PPI, FRET y centro necesitan microscopios específicos para detectar señales de fluorescencia y fácilmente no pueden cuantificar la intensidad de la interacción. Por el contrario, LCI aprovecha de luciferasa de la luciérnaga, que brillará después de reaccionar con su luciferin del substrato. Más importante aún, intensidad PPI puede determinarse el valor de actividad de luciferasa. Así, LCI no sólo indica si dos proteínas interactúan o no, sino que también proporciona información sobre la dinámica de interacción sobre el tratamiento. Aunque hay algunos métodos establecidos para el seguimiento de la interacción dinámica (basada en plasmones resonancia o estabilidad terma turnos)9,10, estos enfoques requieren instrumentos delicados o etiquetado específico. En cambio, es más fácil de realizar y detectar LCI.
El principio de LCI es que las mitades amino terminal y carboxilo-terminal de luciferasa (denominado N-Luc o C-Luc, respectivamente) fueron fusionados con la proteína A y B y estas dos proteínas al mismo tiempo se expresaron en las células vegetales la fusión. Si protein A interactúa con la proteína B, entonces las dos mitades del luciferase serán reconstituidas para ser una enzima luciferase activo. Actividad de luciferasa puede detectarse con un luminómetro o una cámara CCD. No es necesario obtener transformantes estables para LCI; expresión transitoria es suficiente para obtener un resultado de la interacción de alta calidad.
ANILLO tipo E3 ubiquitina ligasa constitutiva photomorphogenic 1 (COP1) interactúa con un gran número de factores de transcripción y promueve su degradación por el proteosoma 26S del11. Algunos de estos factores de transcripción dirigido por COP1 son reguladores positivos para photomorphogenesis. En la oscuridad, COP1 interactúa con supresor de fitocromos A-105 1 (SPA1), que mejora la COP1 E3 actividad8. Después de la percepción de la luz, fotorreceptores abrogan la interacción COP1-SPA1 para inhibir la actividad de COP1 y luego estabilizar COP1 sustratos12,13,14. Este ejemplo ilustra la importancia biológica de PPI de estudiar y determinar la dinámica PPI.

<table><tbody><tr><td><solución >transformación fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Ácido morfolineetanosulfónico</td><td>VETEC V900336</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27.8 mM Glucosa</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&times; 6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 y mu; M Acetosiringona</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5,7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><tampón de trabajo > luciferina</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Sal de potasio de luciferina</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0.025% Triton X-100</td><td>VETEC V900502</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O a 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Las interacciones proteína-proteína son mecanismos fundamentales de transmisión transducción de señales en procesos celulares más; por lo tanto, la identificación de pares de interacción novedosa proteína-proteína y monitoreo de dinámicas de interacción de la proteína son de particular interés para revelar cómo las plantas responden a factores ambientales o señales de desarrollo. Una plétora de enfoques se han desarrollado para examinar las interacciones de proteínas, ya sea in vitro o en vivo. Entre ellos, la complementación de luciferase recientemente establecido imaging (LCI) es el método más simple y rápido para demostrar en vivo las interacciones proteína-proteína. En este ensayo, la proteína A o proteína B se fusiona con la mitad terminal amino o carboxilo terminal de la luciferasa, respectivamente. Cuando proteína interactúa con la proteína B, las dos mitades del luciferase serán reconstituidas para formar una enzima luciferasa funcional y activo. Actividad de luciferasa puede grabarse con una cámara CCD o un luminómetro. En comparación con otros enfoques, el análisis LCI muestra las interacciones proteína-proteína cualitativa y cuantitativamente. Infiltración de Agrobacterium en hojas de Nicotiana benthamiana es un sistema ampliamente utilizado para la expresión transitoria de proteínas. Con la combinación de LCI y expresión transitoria, estos enfoques demuestran que la interacción física entre COP1 y SPA1 fue reducida gradualmente después del tratamiento del jasmonate.

Tres pasos principales pueden ser singularizados en el presente Protocolo de complementación de la luciferasa para estudiar proteínas interacciones en vivo, incluyendo el crecimiento de las plantas, infiltración de tabaco y el ensayo de luciferasa. El paso más crucial en el presente Protocolo es infiltración de líquido a. tumefaciens en hojas de N. benthamiana (figura 1).
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Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar cuantitativamente las interacciones proteína-proteína en un sistema de expresión transitoria. Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de transacción de señales cuaquánicas, como cómo monitorear cuantitativamente las direcciones de nuestras proteínas después de un tratamiento químico o ambiental. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un luminómetro o una cámara CCD para detectar la actividad lucifera, que representa la intensidad de la dirección de la proteína, por lo que los resultados son más precisos.Para comenzar este procedimiento, agregue un mililitro de una solución que contenga hipoclorito de sodio al cinco por ciento y tritón x cien coma cero a un tubo de microcentrífuga de un coma cinco mililitros que contenga semillas. Deje reposar la solución durante cinco minutos para esterilizar las semillas. Luego, lave las semillas con agua estéril cinco veces.Suspender las semillas lavadas en doscientos microlitros de agua estéril. Con puntas finas, coloque con cuidado las semillas individuales sobre la superficie del medio de agar MS plateado. Almacene los platos a cuatro grados centígrados durante tres días para sincronizar la germinación.Después de esto, mantenga las placas medianas en condiciones normales de crecimiento durante diez días. Transfiera las plántulas en germinación al suelo, asegurándose de no dañar las raíces. Cubra la bandeja con una cubierta de plástico transparente durante la noche para mantener la humedad.Cultive las plantas en una sala de crecimiento controlado durante siete semanas, cuando estarán listas para la infiltración de agrobacterium tumefaciens. Para empezar, entregue ciento cincuenta nanogramos de plásmidos en la cepa de células competentes a-tumefaciens GV3101. Colocar los tubos que contienen el cultivo de a-tumefaciens en un agitador e incubar durante cuatro horas.Con una varilla de vidrio, transfiera el cultivo de los tubos a los medios LB. Cultivo de a-tumefaciens y medio de agar LB a 28 grados centígrados durante cuatro días. A continuación, prepárese para inocular una sola colonia de a-tumefaciens de cada placa en su propio tubo que contiene tres mililitros de medio líquido LB.Agitar a 280 RBM a 28 grados centígrados durante 24 horas para propagar el cultivo. Luego, transfiera 75 microlitros del cultivo bacteriano a 15 mililitros de medio líquido LB fresco que contenga 15 microgramos por mililitro de kanamicina y 50 microgramos por mililitro de rifampicina. Cultive las bacterias a 220 RPM a 30 grados Celsius durante aproximadamente 8 horas hasta que OD600 esté entre 0,5 a 1.Después de esto, transfiera el cultivo a tubos de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a 4000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet en 15 mililitros de solución de transformación.Centrifugar a 4000 veces la gravedad y 4 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, repita el paso de suspensión y centrifugación una vez más. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet en 5 mililitros de solución de transformación.Deje reposar el palet resuspendido durante dos horas a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. A continuación, añada la solución de transformación al OD600 que sea 0,5 o combine dos muestras con el mismo volumen para probar las interacciones de proteínas emparejadas. Con una aguja de jeringa de un mililitro, infiltre las células suspendidas en la cuarta a la séptima hoja.Después de esto, cubra inmediatamente las plantas con una cubierta de plástico negro durante 12 horas. En primer lugar, las plantas deben estar muy sanas para garantizar el éxito. En segundo lugar, asegúrese de no dañar ninguna hoja durante el proceso de infiltración.Mantenga la bandeja en oscuridad durante 12 horas. Luego, cultive las plantas en condiciones normales durante 2 a 4 días antes de detectar la actividad de la luciferasa. Para comenzar el método de diagnóstico por imágenes, separe una hoja infiltrada.Coloque todo el folleto en una placa de medio de agar MS. Con una botella rociadora de 50 mililitros, rocíe el tampón de trabajo luciferón en el lado adaxial de las hojas. Luego, manténgalo en la oscuridad durante 5 minutos para apagar la autofluorescencia de la clorofila.Utilice un aparato de imagen CCD refrigerado por luz más baja enfriado a menos 30 grados Celsius para capturar imágenes con un tiempo de exposición lleno de luz de 50 milisegundos y un tiempo de detección de luminiscencia de 1 minuto. Después de esto, corte los fragmentos de hojas del área de infiltración de las hojas de N-benthamiana. Sumerja los fragmentos en 100 microlitros de agua desionizada en los pocillos de placa blanca de 96 pocillos.Agregue diez microlitros de tampón de trabajo luciferón. Deje reposar el plato 5 minutos. A continuación, realice cualquier tratamiento específico que desee para estudiar la dinámica de la interacción de las proteínas y mida la luminiscencia directamente con un luminómetro comercial.Aquí se muestra la demostración de la actividad lucifera para representar las interacciones de COP 1 SPA 1. La actividad lucifera, que se detecta por luminiscencia, es fotografiada por una cámara CCD. Se ha observado que las interacciones COP 1 SPA 1 dan lugar a una mutación del cobre de la luciferasa funcional.A continuación, se determina la actividad de la luciferasa bajo el tratamiento con Jazmín 8 a lo largo del tiempo. Se observa que las interacciones de COP 1 SPA 1 representadas por la actividad de la luciferasa disminuyen gradualmente en la oscuridad. El tratamiento con Jasmine 8 reduce aún más estas interacciones.Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en 1 semana, después de que las plantas estén listas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las plantas sanas. Infiltre las hojas con cuidado e incluya los controles correctamente.Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de las transacciones de señales exploren la dinámica de la interacción proteína-proteína de una manera rápida. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar plantas de tabaco, infiltrar agrobacterias en las hojas de tabaco y detectar actividades luciferas.

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

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Investigación

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Biología

Este artículo muestra cómo utilizar correctamente el BioRad Helios pistola de genes para introducir ADN plásmido en las células epidérmicas de cebolla y la forma de prueba para las interacciones proteína-proteína en las células de la cebolla basa en el principio de fluorescencia de Complementación bimolecular...

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Este video muestra el ensayo de complementación de luciferasa dividida para detectar interacciones proteína-proteína. En este ensayo, las proteínas de interés se marcan con fragmentos pequeños y grandes de la enzima luciferasa. Cuando las proteínas interactúan, los fragmentos grandes y pequeños se combinan para formar un complejo enzimático activo, que en presencia de un sustrato específico, libera una luminiscencia brillante que se puede medir.

Ensayo de complementación de luciferasa dividida para identificar interacciones específicas proteína-proteína

La producción de proteína transitoria en plantas de Nicotiana sobre la base de infiltración al vacío con agrobacterias llevando vectores de lanzamiento (virus del mosaico del tabaco a base) es un enfoque rápido y económico para producir antígenos de vacunas y proteínas terapéuticas. Hemos simplificado el procedimiento mejorado y la acumulación de destino mediante la optimización de las condiciones de cultivo de bacterias, la selección de especies huéspedes, y co-introducción de supresores de...

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

A nivel subcelular, los eventos de señalización son modulados dinámicamente por señales de desarrollo y ambientales. Aquí describimos un protocolo que emplea el sistema de expresión transitoria del tabaco para monitorear la interacción dinámica proteína-proteína y para revelar la organización espacial de la transducción de señales en células vegetales.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

El protocolo presentado aquí está destinado a demostrar la ocurrencia de interacciones heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi con N- y/o C-termini expuestas citoplasmáticamente en células vivas de mamíferos utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida.

Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida

Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con GFP en Nicotiana benthamiana. Este protocolo se puede extender a la purificación y visualización de numerosas proteínas que utilizan cromatografía de columna. Además, el protocolo es adaptable al laboratorio de enseñanza en persona y en la universidad virtual, proporcionando una exploración basada en proyectos.

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

Aquí presentamos, un método para visualizar la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas utilizando proteínas marcadas con fluorescentes mediante el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC. Este método es valioso para estudiar los complejos de interacción proteína-proteína in vivo.

Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica de imagen para detectar interacciones de proteínas en células vivas. Aquí, se presenta un protocolo FRET para estudiar la asociación de enzimas modificadoras de histonas con factores de transcripción que las reclutan a los promotores objetivo para la regulación epigenética de la expresión génica en tejidos vegetales.

Investigación de las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción in vivo mediante la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

Este protocolo describe la selección de marcadores plasmodesmales óptimos para análisis basados en microscopía confocal de proteínas dirigidas a plasmodesmos durante las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal.

Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

Aprende a detectar cuantitativamente interacciones proteína-proteína en hojas de Nicotiana benthamiana mediante ensayo de luciferasa. Este método rápido utiliza luminometría para estudiar dinámicas de señalización celular.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica (Video) | JoVE Journal

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

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