Lentivirus de producción

Este procedimiento comienza con el transecto de 2 9 3 células T con lentivirus, plásmidos y vectores de empaquetamiento viral, el sobrenadante viral se recolecta después de un período de incubación de al menos 48 horas. El snat se filtra para concentrarse con una ultracentrífuga después de la ultracentrifugación. El pellet viral se resuspende con PBS para obtener el título del virus, primero se diluye el virus concentrado en medios completos, luego se realiza una dilución en serie para infectar las células con lentivirus.

Hola, soy Shein Wong del laboratorio de Michael McManus en el Centro de Diabetes de la Universidad de California en San Francisco. Soy Michael McManus. Hoy te mostraremos un procedimiento para la producción de lentivirus.

Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para producir lentivirus para la interferencia de ARN. Así que comencemos. Para comenzar este protocolo, prepare el ADN con el que transfectar las 2 9 3 células T.

Primero diluir el reactivo de transfección del gen FU seis en un tubo de 1,5 mililitros mezclando 30 microlitros Fuji six con 600 microlitros de medio libre de suero. Tenga cuidado de no dejar que Fuji toque el costado del tubo mientras lo administra a la temperatura ambiente de incubación media durante cinco minutos. A continuación, en la tapa del tubo, mezcle cuatro microgramos de plásmido lentiviral con 1,33 microgramos.

Cada vectores de empaquetamiento viral de tercera generación. El plásmido lentiviral contiene el ADN. El virus se insertará en el genoma de cada célula infectada, mientras que los vectores de empaquetamiento contienen genes para todas las demás proteínas necesarias para hacer un virus de lentejas, cierre la tapa y mezcle invirtiendo el tubo unas cuantas veces.

Incubar el ADN y el reactivo de transfección durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente. Ahora es el momento de transfectar 2 9 3 células con el ADN que ha preparado, use células que haya sembrado con 24 horas de anticipación y que hayan alcanzado un 50 a 70% de fluidez en la campana de cultivo de tejidos, pipetee todo el ADN preparado en la placa 2 9 3 mezclado suavemente inclinando la placa hacia adelante y hacia atrás, Regrese las células a la incubadora y permita que la producción viral continúe durante 48 a 96 horas antes de la cosecha. Durante la incubación, las células 2 9 3 producen lentivirus cuyos genomas contienen una copia de ARN del ADN de interés.

Ahora es el momento de recoger el virus. Saca las células de la incubadora. Tenga a mano en la campana de cultivo de tejidos, un filtro de jeringa de 0,4 o cinco micras, una jeringa desechable de 10 mililitros y un tubo de centrífuga Beckman UltraClear.

Use la jeringa desechable para eliminar el sobrenadante, que ahora contiene el virus. Coloque un filtro de jeringa de 0,45 micras en la punta y filtre el virus en un tubo de centrífuga Beckman UltraClear. El filtro permite que solo los virus y no las células pasen antes de desechar, incubar todas las células productoras de virus.

Placas de cultivo, jeringas y filtros en lejía al 10% durante 45 minutos. Ahora que ha recolectado y filtrado el virus, es hora de concentrar primero el virus por ultracentrifugación. Utilice DMEM sin suero para equilibrar todos los tubos que contienen virus a una distancia de 0,2 gramos entre sí.

A continuación, cargue los tubos de centrífuga equilibrados en los cubos del rotor SW 41 TI o SW 28. Selle los cucharones del rotor y engánchelos al rotor. A continuación, coloque el rotor dentro de la ultracentrífuga.

Haga girar el virus durante unos 90 minutos a cuatro grados centígrados a 25.000 rpm en un rotor SW 41 TI, o a 24.000 rpm en un rotor SW 28. Después de la centrifugación, regrese a la campana de cultivo de tejidos e invierta el tubo para verter el SNAT en un recipiente que contenga un 10% de lejía. Use una toallita Kim para absorber el exceso de líquido alrededor del pellet e invierta el tubo en una rejilla conveniente durante no más de cinco minutos hasta que esté listo para volver a suspender el pellet.

Para volver a suspender el pellet viral, use una punta de filtro para agregar 100 microlitros de PBS prefiltrado estéril a su tubo. A continuación, pipetea hacia arriba y hacia abajo unas 20 veces. Deje el virus a cuatro grados durante la noche para completar la resuspensión.

Puede almacenar las preparaciones virales a cuatro grados durante aproximadamente una semana y a menos 80 grados hasta por un año. Recuerde tratar todos los tubos vacíos con lejía al 10% antes de desecharlos. Si tiene la intención de usar la preparación viral durante más de una semana, se mantendrá en el refrigerador.

Haga alícuotas mínimas de cinco a 20 microlitros para experimentos futuros y una alícuota de tres a cinco microlitros para la congelación de la titulación y almacene las alícuotas en aproximadamente menos 80. El siguiente paso es determinar el título viral. Si ha incluido un gen indicador fluorescente en su plásmido lentiviral, las células infectadas emitirán fluorescencia y puede determinar el título viral mediante citometría de flujo.

Para empezar, diluya tres microlitros de virus concentrado en 1,5 mililitros de medio completo en pocillos, de uno a seis. En una sola fila de una placa de 96 pocillos. Realice las siguientes diluciones en serie en los seis pocillos a 100 microlitros de DM.To el primer pocillo agregue 100 microlitros de medio sin virus.

Este es tu control sin mancha. Al segundo, agregue 100 microlitros del virus diluido al tercero. Bien agregue 100 microlitros de la mezcla del segundo pocillo al cuarto.

Bueno, agregue 100 microlitros del tercer pocillo al quinto. Bien agregue 100 microlitros del cuarto pocillo y al sexto. Pues añadimos 100 microlitros del quinto.

Bueno, finalmente saca 100 microlitros del sexto pocillo y deséchalo y blanquea, lleva el volumen total de todos los pocillos a 200 microlitros con DMEM. Con cada dilución, la concentración viral disminuye a la mitad. Tenga en cuenta que estas son solo diluciones sugeridas, que deberían funcionar bien para ajustar la mayoría de los virus concentrados.

Si su virus tiene un título bajo o no está concentrado, es posible que deba ajustar sus diluciones. Trate cualquier virus diluido no utilizado con lejía al 10% durante 45 minutos antes de desecharlo en un contenedor de desechos de riesgo biológico. Agregue alrededor de 15,000 células T sanas que se dividen activamente 2 9 3 a cada uno de los seis pocillos.

Puede usar una sola placa de 96 pocillos para valorar 16 preparaciones virales, completar los pocillos a 200 microlitros, devolver las células a la incubadora y permitir que la infección continúe durante al menos 48 horas. Después de la incubación, analice la fluorescencia celular con un citómetro de flujo. Puede utilizar el porcentaje de células fluorescentes por pocillo para determinar el título o el número de partículas virales infecciosas por mililitro de virus añadido.

Calcule el número de unidades infecciosas por mililitro con la siguiente fórmula al interpretar el flujo. Resultados del citómetro. Tenga en cuenta que solo se pueden lograr cálculos precisos de títulos cuando las células infectadas no han recibido más de una integración viral por célula.

Para asegurarse de que este sea el caso, utilice células con una tasa de infección inferior al 15% para los cálculos. Es probable que las células con tasas de infección más altas hayan recibido múltiples integraciones virales por célula. La dilución sugerida en el paso dos debería producir varias muestras dentro de este rango de infección.

Lo ideal es utilizar varias muestras para generar un gráfico de valoración a partir del cual se pueda calcular el título final. La fórmula calculada a partir de la línea lineal ajustada se puede utilizar para calcular el título viral, pero puede calcular el título utilizando una sola muestra si es necesario. Se puede esperar un título de una vez 10 a la séptima unidades de transducción por mililitro para el virus no concentrado, y de una vez 10 a la octava unidades de transducción por mililitro para el virus concentrado.

Acabamos de mostrarte cómo producir lentivirus al realizar este procedimiento. Es importante cumplir con todas las normas de bioseguridad y deshacerse de los residuos de forma adecuada. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.