Name: Lentivirus de producción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a producir lentivirus usando células 293T humanas mediante transfección, recolección de sobrenadante viral y ultracentrifugación. Este método permite obtener títulos virales precisos para aplicaciones de terapia génica.

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Sandler Asma Centro de Investigación Básica (SABRE) Sandler Fundación

Parte 1: La transfección de células HEK 293 células para producir lentivirus * 24 horas antes de la transfección, la placa de 2,5 X 10 6 células en una placa de 10 cm para una confluencia del 50-70% al día siguiente. <ol><li> Inicio este protocolo mediante la preparación de ADN con la que uno más tarde transfectar una de las células para hacer virus. En primer lugar, diluir FuGENE 6 Transfección reactivo Roche, un reactivo de los lípidos que componen las células toman el ADN. En un tubo de 1,5 ml, pipeta de 30μl FuGENE 6 en 600ul medio libre de suero (SFDMEM). Tenga cuidado de no dejar que FuGENE tocar la parte del tubo que se introduce en el medio. Deja que este FuGENE y mezclar SFDMEM e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> En la tapa del tubo, mezclar 4 mg lentiviral plásmido con 4 mg cada 3 ª generación vectores virales embalaje (pMDL, PRSV y pVSV-G). El lentiviral plásmido contiene el ADN del virus se inserta en el genoma de cada célula que infecta, mientras que los vectores de envases contienen genes de todas las otras proteínas necesarias para hacer un lentivirus. </li><li> Cierre la tapa y mezclar invirtiendo el tubo varias veces. </li><li> Incubar durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Pipeta de todo el contenido del tubo en la placa 293. Mezclar suavemente por la placa de inclinación hacia atrás y adelante. </li><li> Volver a las células a la incubadora y permiten la producción viral que continúe durante 48-96 horas antes de la cosecha. </li><li> Durante la incubación, las células 293 transcribir el ADN de interés de la lentiviral plásmido, creando una copia de ARN de la construcción de lentiviral. También se transcriben y traducen los genes en los vectores de envases en las proteínas virales. Estas proteínas se procederá a realizar los virus de ARN que contiene la versión de su construcción lentiviral, que el virus se invertirá transcribir e insertar en los genomas de todas las células que infecta. </li></ol> Parte 2: Cosecha lentivirales <ol><li> Después de un período de incubación, tomar células de la incubadora y el uso de una jeringa desechable, de 10 ml para separar el sobrenadante, que ahora contiene el virus. Habrá alrededor de 10 ml de sobrenadante. </li><li> Coloque un filtro de jeringa 0.45μM a la punta y filtrar los virus en un tubo de ultracentrífuga Beckman. El filtro sólo permite que los virus, y no a las células a pasar. </li><li> Antes de desechar, se incuban todas las células produzcan más virus, placas de cultivo, las jeringas y los filtros en el 10% de lejía durante 45 minutos. </li></ol> Parte 3: Concentración lentivirales a través de ultracentrifugación <ol><li> Carga tubos de centrifugación en SW-41Ti o SW-28 cubos del rotor. </li><li> El uso de suero libre de DMEM para equilibrar todos los virus que contienen los tubos dentro de 0.2g. </li><li> Se cierre cubos del rotor y engancharlos en el rotor antes de colocar el rotor dentro de la ultracentrífuga </li><li> Girar el virus durante 90 minutos en una ultracentrífuga a 4 ° C a 25.000 rpm en un rotor SW-41Ti o 24.000 rpm en un rotor SW-28. </li><li> En una campana de cultivo de tejidos, invierta los tubos boca abajo para verter el sobrenadante en un recipiente con lejía al 10%. </li><li> Use un Kimwipe para absorber el exceso de líquido alrededor de la bolita y se invierte el tubo en un estante conveniente para no más de cinco minutos. </li><li> Para volver a suspender el pellet viral, utilice un filtro de punta a añadir 100 ml de PBS estéril en el tubo, entonces la pipeta hacia arriba y abajo unas 20 veces. </li><li> Deje el virus a 4 ° C durante la noche para completar la re-suspensión. Uno puede almacenar prepara viral a 4 grados durante aproximadamente 1 semana y a -80 grados durante un máximo de un año. Recuerde que debe tratar a todos los tubos de vacío con lejía al 10% antes de desecharlos. </li><li> Si se piensa en usar la preparación viral por más de la semana 1, hacer alícuotas mínimas de 5-20μl para futuros experimentos y una alícuota de 3 a 5μl de la titulación. Congelar y almacenar las alícuotas a menos 80. </li></ol> Parte 4: Valoración lentivirales mediante citometría de flujo <ol><li> El siguiente paso es determinar el título viral por citometría de flujo. Este método sólo funciona en los casos en que los lentivirus plásmido contiene un gen fluorescente. La idea es que cuando el virus infecta una célula, se introduce el ADN del plásmido lentiviral en el genoma de la célula. La célula infectada luego transcribir y traducir los genes que se incluyen en el plásmido lentiviral, y si incluye un gen fluorescente, fluorescente las células infectadas se. El nivel de fluorescencia representa la potencia, o título, de los virus. </li><li> Para cada cepa viral que se titularon, diluir 3 l de virus concentrado en 1,5 ml de medio completo (DMEM, pen-estreptocócica, glutamina, FBS). </li><li> En los pozos de 6.1 en una sola fila de una placa de 96 pocillos, realizar las diluciones seriadas siguiente: a los 6 pozos de añadir 100 ml de DMEM completo los medios de comunicación. Para el primer pozo de añadir 100μl de los medios de comunicación, sin virus (esta es su control sin manchas), para el segundo y añadir 100 ml del virus diluido (lo que equivale a 1 ml de virus sin diluir), a la tercera y añadir 100 mlde la mezcla de la segunda y, a la cuarta y añadir 100 ml de la tercera y, a la quinta y añadir 100μl del pozo cuarto y el sexto y añadir 100 ml de la quinta también. Finalmente tome 100 ul de la sexta y así descartar en lejía. Una serie de dilución se realizó en el que cada pozo tiene la mitad del volumen de los virus en comparación con el anterior. </li><li> Obtener un volumen total en todos los pozos de 200μl. Tenga en cuenta que se trata de diluciones sólo sugirió, que debería funcionar bien para la titulación de los virus más concentrada. Si el virus es baja en el título, o sin concentrar una posible necesidad de ajustar las diluciones. </li><li> Tratar cualquier virus diluido no utilizado con lejía al 10% durante 45 minutos antes de desecharlos en un contenedor de residuos biopeligrosos. </li><li> Añadir ~ 15000 sano, las células se dividen activamente 293 a cada uno de los seis pozos. Una sola placa de 96 pocillos se puede utilizar para títulos de 16 preparaciones virales. </li><li> Volver a las células incubadora grado 37 con 5% de CO 2 y que la infección de proceder por lo menos durante 48 horas. </li><li> Después de la incubación, las células son analizadas para la expresión reportero (en nuestro caso la fluorescencia) con un citómetro de flujo. Las partículas virales se cuantifica el porcentaje de células fluorescentes por pozo. </li></ol> Calcular el número de unidades infecciosas por ml con la siguiente fórmula: <div style="text-align:center;"> (Número de células por pocillo en el día de las células de la infección por el reportero X positivo) X 1000 ______________________________________________________ ml de vector añadido a bien </div> Parte 5: Resultados del representante: Después de un después de la transfección de 48 horas el período de incubación, la placa de 293 células debería ser al fluorescentes alrededor del 90%. Un alto porcentaje de células fluorescentes es una indicación de un alto porcentaje de virus productores de células. Después de la centrifugación, el pellet viral es apenas visible cuando la resuspensión. Esto es normal ya que la pastilla es clara y muy pequeños. Al interpretar los resultados del citómetro de flujo, tenga en cuenta que sólo se puede lograr cálculos exactos título cuando se infectan (fluorescentes), las células no han recibido más de una integración viral por célula. Con el fin de asegurar que este es el caso, utilizar las células con una tasa de &lt;15% de infección para los cálculos. Las células con las tasas de infección más altos probablemente han recibido varios integrantes virales por célula. Las diluciones que se sugiere en el paso 2 debe rendir varias muestras dentro de este rango de infección. Lo ideal es utilizar varias muestras para generar un gráfico de titulación (lineal) de la cual se puede calcular el título final, pero se puede calcular el título con una sola muestra, si es necesario. Uno puede esperar título de 1,0 x 10 7 TU / ml de concentrado sin virus y 1.0 x 10 8 TU / ml de virus concentrados.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM Células HEK 293T Penicilina-estreptomicina Glutamina Solución salina tamponada con fosfato FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lejía</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 10 cm Placas de cultivo celular de 96 pocillos </td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta filtradas</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 ml Jeringa Filtro de jeringa (0,45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos para ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular al 5 % de CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotador Beckman SW41T.I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirus de producción

Lentivirus Production

ARN de interferencia (ARNi) es un sistema de silenciamiento de genes en las células vivas. El ARN de interferencia, en la secuencia de genes homólogos a corto RNAs de interferencia (siRNA) son silenciadas en el estado post-transcripcional. ARN de horquilla corta, los precursores de siRNA, se puede expresar mediante lentivirus, lo que permite el ARNi en una variedad de tipos de células. Los lentivirus, como el virus de inmunodeficiencia humana, son capaces de infectar tanto a la división y que no se dividen las células. Vamos a describir un procedimiento que a los lentivirus paquete. Envase se refiere a la preparación de virus competentes de vectores de ADN. Lentiviral los sistemas de producción de vectores se basan en un &#39;split&#39; del sistema, donde ha sido el genoma del virus natural de división en las construcciones de plásmido auxiliar individual. Esta división de los diferentes elementos virales en cuatro vectores separados disminuye el riesgo de crear un virus capaz de replicarse por recombinación accidental del genoma del lentivirus. Aquí, un vector que contiene la shRNA de interés y tres vectores de empaquetamiento (p-VSVG, PRSV, pMDL) son transfectadas transitoriamente en 293 células humanas. Después de al menos un período de incubación de 48 horas, el sobrenadante que contiene el virus se recoge y se concentra. Finalmente, título del virus se determina por el reportero (fluorescentes), expresión con un citómetro de flujo.

Para que los lentivirus, los vectores de ADN se transfectadas en células humanas 293. Después de la cosecha y la concentración del sobrenadante, título del virus se determina mediante la expresión de fluorescencia con un citómetro de flujo.

Lentivirus de producción

La interferencia de ARN (ARNi) es un sistema de silenciamiento génico en células vivas. En la ARNi, los genes con secuencias homólogas a los ARN interferentes cortos (siRNA) son...

Este procedimiento comienza con la transducción de células 293T con lentivirus, plásmido y vectores de empaquetamiento viral; el sobrenadante viral se recoge tras un período de incubación de al menos 48 horas. El sobrenadante se filtra y se concentra mediante ultracentrifugación. El precipitado viral se resuspende en PBS para obtener la titulación del virus: primero se diluye el virus concentrado en medio completo, luego se realiza una dilución seriada para infectar células con lentivirus.Hola, soy Shein Wong del laboratorio de Michael McManus en el Centro de la Diabetes de la Universidad de California en San Francisco. Soy Michael McManus. Hoy les mostraremos un procedimiento para la producción de lentivirus.Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para producir lentivirus destinados a la interferencia de ARN. Comencemos. Para iniciar este protocolo, prepare el ADN con el que se transfectarán las células 2 9 3 T.Primero, diluya el reactivo de transfección FU gene seis en un tubo de 1,5 mililitros mezclando 30 microlitros de Fuji seis con 600 microlitros de medio sin suero. Tenga cuidado de no dejar que Fuji toque las paredes del tubo al agregarlo al medio; incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, en la tapa del tubo, mezcle cuatro microgramos de plásmido lentiviral con 1,33 microgramos.Cada vector de empaquetamiento viral de tercera generación. El plásmido lentiviral contiene el ADN. El virus se insertará en el genoma de cada célula que infecte, mientras que los vectores de empaquetamiento contienen los genes para todas las demás proteínas necesarias para producir un virus lentiviral; cierre la tapa y mezcle invirtiendo el tubo varias veces.Incube el ADN y el reactivo de transfección durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente. Ahora es el momento de transfectar las células 293 con el ADN que ha preparado; utilice células que haya sembrado con 24 horas de antelación y que hayan alcanzado una confluencia del 50 al 70 % en la cabina de cultivo celular. Pipetee todo el ADN preparado sobre la placa de células 293 y mezcle suavemente inclinando la placa hacia adelante y hacia atrás. Devuelva las células al incubador y permita que la producción viral continúe durante 48 a 96 horas antes de la recolección. Durante la incubación, las células 293 producen lentivirus cuyos genomas contienen una copia de ARN de su ADN de interés.Ahora es el momento de recolectar el virus. Saque sus células del incubador. Tenga listo en la cabina de cultivo celular un filtro para jeringa de 0,4 o cinco micrones, una jeringa desechable de 10 mililitros y un tubo de centrífuga UltraClear de Beckman.Utilice la jeringa desechable para eliminar el sobrenadante, que ahora contiene el virus. Coloque un filtro de jeringa de 0,45 micrones en la punta y filtre el virus hacia un tubo de centrífuga UltraClear de Beckman. El filtro permite el paso únicamente de virus y no de células; antes de desecharlas, incube todas las células productoras de virus.Incube placas de cultivo, jeringas y filtros en lejía al 10 % durante 45 minutos. Ahora que ha recolectado y filtrado el virus, es momento de concentrarlo mediante ultracentrifugación. Utilice DMEM sin suero para equilibrar todos los tubos que contienen el virus, de modo que su peso no difiera en más de 0,2 gramos entre ellos.A continuación, cargue los tubos de centrífuga equilibrados en los cubos del rotor SW 41 TI o SW 28. Cierre herméticamente los cubos del rotor y colóquelos en el rotor. Luego, coloque el rotor dentro de la ultracentrífuga.Centrifugar el virus durante aproximadamente 90 minutos a cuatro grados Celsius a 25.000 RPM en un rotor SW 41 TI, o a 24.000 RPM en un rotor SW 28. Después de la centrifugación, regresar a la cabina de cultivo celular e invertir el tubo para verter el SNAT en un recipiente que contenga lejía al 10 %. Utilizar una toalla Kim para absorber el exceso de líquido alrededor del precipitado e invertir el tubo en un portatubos adecuado durante no más de cinco minutos, hasta que esté listo para resuspender el precipitado.Para resuspender el sedimento viral, utilice una punta filtrante para agregar 100 microlitros de PBS estéril previamente filtrado al tubo. Luego, pipetee hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces. Deje el virus a cuatro grados durante la noche para completar la resuspensión.Puede almacenar las preparaciones virales a cuatro grados durante aproximadamente una semana y a menos 80 grados durante hasta un año. Recuerde tratar todos los tubos vacíos con lejía al 10% antes de desecharlos. Si tiene la intención de utilizar la preparación viral durante más de una semana, esta se conservará en el refrigerador.Prepare alícuotas mínimas de cinco a 20 microlitros para experimentos futuros y una alícuota de tres a cinco microlitros para la titulación; congele y almacene las alícuotas a aproximadamente menos 80. El siguiente paso consiste en determinar el título viral. Si ha incluido un gen reportero fluorescente en su plásmido lentiviral, las células infectadas fluorescerán y podrá determinar el título viral mediante citometría de flujo.Para comenzar, diluya tres microlitros de virus concentrado en 1,5 mililitros de medio completo en los pocillos del uno al seis, en una sola fila de una placa de 96 pocillos. Realice las siguientes diluciones seriadas en los seis pocillos con 100 microlitros de DM completo. Al primer pocillo añada 100 microlitros de medio sin virus.Este es su control sin teñir. Al segundo, agregue 100 microlitros del virus diluido al tercero. Agregue 100 microlitros de la mezcla del segundo pocillo al cuarto.Añadiremos 100 microlitros desde el tercer pocillo hasta el quinto. Añadiremos 100 microlitros desde el cuarto pocillo hasta el sexto. Añadiremos 100 microlitros desde el quinto pocillo.Finalmente, retire 100 microlitros del sexto pocillo y deseche. Añada lejía y complete el volumen total en todos los pocillos hasta 200 microlitros con DMEM. Con cada dilución, la concentración viral se reduce a la mitad. Tenga en cuenta que estas son solo diluciones sugeridas, que deberían funcionar bien para la titulación de la mayoría de los virus concentrados.Si su virus tiene un título bajo o no está concentrado, es posible que necesite ajustar sus diluciones. Trate cualquier virus diluido no utilizado con lejía al 10 % durante 45 minutos antes de desecharlo en un recipiente de desecho biopeligroso. Añada aproximadamente 15 000 células 293T sanas y en división activa a cada uno de los seis pozos.Puede utilizar una sola placa de 96 pocillos para titular 16 preparaciones virales, completar los pocillos hasta 200 microlitros, devolver las células al incubador y permitir que la infección transcurra durante al menos 48 horas. Después de la incubación, analice la fluorescencia celular utilizando un citómetro de flujo. Puede utilizar el porcentaje de células fluorescentes por pocillo para determinar el título o el número de partículas virales infecciosas por mililitro de virus añadido.Calcule el número de unidades infecciosas por mililitro con la siguiente fórmula al interpretar los resultados del citómetro de flujo. Tenga en cuenta que solo se pueden obtener cálculos precisos del título cuando las células infectadas han recibido no más de una integración viral por célula.Para asegurarse de que este sea el caso, utilice células con una tasa de infección inferior al 15% para los cálculos. Es probable que las células con tasas de infección más altas hayan recibido múltiples integraciones virales por célula. La dilución sugerida en el paso dos debería producir varias muestras dentro de este rango de infección.Utilice idealmente varias muestras para generar una curva de titulación a partir de la cual pueda calcular la titulación final. Se puede utilizar la fórmula calculada a partir de la recta lineal ajustada para determinar la titulación viral, aunque puede calcular la titulación utilizando una sola muestra si es necesario. Se puede esperar una titulación de uno por diez a la séptima unidades transducentes por mililitro para virus no concentrado, y uno por diez a la octava unidades transducentes por mililitro para virus concentrado.Acabamos de mostrarle cómo producir lentivirus al realizar este procedimiento. Es importante cumplir con todas las regulaciones de bioseguridad y desechar los residuos adecuadamente. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Biología

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