Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

La tecnología NanoDrop combina fibra óptica y tensión superficial para retener y medir pequeñas cantidades de muestras como ácidos nucleicos y proteínas. Una pequeña gota de muestra se pipetea directamente sobre el pedestal inferior. A continuación, un pedestal óptico superior acopla la muestra para formar una columna.

El pedestal se mueve automáticamente para ajustar la longitud óptima del camino. El acortamiento de la longitud de la ruta elimina la necesidad de realizar diluciones para la mayoría de las muestras de proteínas, la medición se realiza en segundos y se muestran los resultados del espectro visual. Hola, soy Lynn Kalhorn y trabajo en los laboratorios NanoDrop de Thermo Fisher Scientific.

Hoy mostraremos un procedimiento para determinar la concentración de proteínas utilizando un innovador espectrofotómetro de micro volúmenes. El espectrofotómetro NanoDrop 2000 C utiliza un innovador sistema de retención de muestras que se basa en la tensión superficial de los líquidos para mantener y medir muestras de microvolumen entre dos pedestales ópticos sin el uso de cubetas o capilares. La muestra de micros se coloca directamente sobre la superficie de detección y se crea una columna de líquido entre los extremos de las fibras ópticas por tensión superficial.

Esta columna de líquido forma una trayectoria óptica vertical. Una lámpara de destello de xenón proporciona la fuente de luz y un espectrómetro que utiliza una matriz CCD lineal se utiliza para analizar la luz que pasa a través de la muestra. Eliminar del sistema los dispositivos de contención tradicionales, como las cubetas, tiene varias ventajas.

Se necesitan cantidades muy pequeñas de muestra para la medición. La limpieza de uno a dos microlitros simplemente requiere limpiar las superficies ópticas con una toallita de laboratorio y la longitud de la ruta cambia automáticamente en tiempo real durante la medición. Además, el acortamiento de la longitud del camino permite la medición de concentraciones más altas, lo que elimina efectivamente la necesidad de realizar la dilución para la mayoría de las muestras de proteínas.

En los casos en los que se justifica un veterinario, como los estudios cinéticos, el NanoDrop 2000 C proporciona una opción de vete en el mismo espectrofotómetro. Para este protocolo, utilizaremos la opción de pedestal de micro volumen para determinar la concentración de proteínas. El método de proteína A dos 80 es aplicable a proteínas purificadas que contienen residuos de triptófano, tirosina y fenilalanina o enlaces de sulfuro de cisteína diss de cisteína y exhiben absorbencia a 280 nanómetros.

Para comenzar este procedimiento, seleccione la aplicación de proteína A dos 80 en el menú principal. Si aparece la ventana de verificación de longitud de onda, asegúrese de que el brazo esté hacia abajo, seleccione el tipo de muestra que se medirá en la lista desplegable. La configuración predeterminada se recomienda para la mayoría de las mezclas de proteínas desconocidas en las que una ABSORBENCIA equivale a un miligramo por mililitro.

Si se mide una proteína purificada previamente caracterizada, se puede introducir el coeficiente de extinción masiva o el coeficiente de extinción molar. Para determinar la concentración de proteínas con mayor precisión, elija las unidades de concentración de la lista desplegable adyacente al cuadro codificado por colores. A continuación, establezca un espacio en blanco.

Utilizando un tampón adecuado, es importante utilizar el tampón en el que está suspendida la proteína. El tampón utilizado debe tener el mismo pH y una fuerza iónica similar a la solución de muestra. Debido a la variabilidad en la tensión superficial entre las diferentes proteínas, recomendamos cargar dos microlitros de muestras para asegurar la formación adecuada de la columna.

Para cargar, toque la punta de la pipeta de baja retención con la superficie del pedestal inferior mientras expulsa la solución para evitar que la solución se adhiera al exterior de la punta de la pipeta, expulse menos de la cantidad total de muestra para evitar el reventón y la introducción de burbujas en la muestra. Una vez cargada la muestra, baje el brazo, haga clic en blanco. Una vez finalizado el borrado, limpie la solución en blanco de los pedestales inferior y superior.

Utilizando una toallita seca de laboratorio antes de tomar una alícuota para la medición, es importante asegurarse de que la muestra sea homogénea. Mezcle la muestra de manera suave pero completa mediante un vórtice suave utilizando un RPM de nivel medio para evitar la introducción de microburbujas en el fluido. Introduzca un ID de muestra en el campo correspondiente.

Cargue dos microlitros de la primera muestra como se muestra anteriormente para el blanco, baje el brazo y haga clic en medir Cuando se complete la medición, limpie la muestra de los pedestales inferior y superior. Con una toallita seca de laboratorio, mida todas las demás muestras de la misma manera utilizando una alícuota fresca de dos microlitros de muestra para cada medición. Una toallita de laboratorio ordinaria sin pelusa suele ser suficiente para limpiar los pedestales ópticos entre mediciones.

El único disolvente que es incompatible y no debe utilizarse son las soluciones de ácido fluorhídrico y los reactivos que contienen tensioactivos pueden descondicionar las superficies del pedestal de medición con el tiempo, evitando la formación de la columna de líquido de la muestra. Un aplanamiento de la gota en el pedestal inferior es indicativo de que la superficie óptica se vuelve incondicionada para ser reacondicionada. Las superficies del pedestal pueden pulirlas vigorosamente con una toallita de laboratorio o el método preferido es utilizar el compuesto de reacondicionamiento de pedestal PR one de NanoDrop, según las indicaciones.

Si la muestra es una solución de proteína no caracterizada, lisado celular o extracto de proteína cruda, recomendamos utilizar uno de los métodos colormétricos preconfigurados disponibles en el NanoDrop 2000 C. Estos métodos colormétricos incluyen los ensayos BCAP six 60 Bradford y Lowy. Aquí se demostrará el ensayo BCA. Los reactivos necesarios para el ensayo BCA están contenidos en el kit compatible con el agente reductor thermos scientific BCA, el reactivo A, B, C, A, el reactivo B y los estándares de albúmina sérica bovina.

Utilizaremos el conjunto de albúmina prediluida de Pierce, ya que nuestros estándares se refieren a la literatura de BCA de Pierce para determinar qué estándares de ensayo son apropiados para su circunstancia. Para preparar los reactivos, primero equilibre todas las proteínas desconocidas y los estándares de proteínas a temperatura ambiente y mezcle bien mediante un vórtice suave. Utilice un nivel medio de RPM para evitar introducir microburbujas en el fluido.

Ya que las burbujas pueden afectar negativamente a las lecturas. Prepare suficiente reactivo de trabajo fresco para los estándares y las muestras que se medirán utilizando una proporción de 50 a uno del reactivo A a B.In este ejemplo, prepararemos tres mililitros de reactivo de trabajo para cubrir los cinco estándares de referencia y seis muestras. El ensayo de BCA regular cubre un rango dinámico más amplio y utiliza una proporción de reactivo a proteína de 20 a uno, mientras que el ensayo de micro BCA es más sensible y tiene un rango dinámico más estrecho que utiliza una proporción de reactivo a proteína de uno a uno.

Debido a que estamos realizando el ensayo regular de BCA, prepararemos una proporción de 20 a uno de reactivo de trabajo por muestra. Agregue 190 microlitros de reactivo de trabajo a cada tubo con suficientes tubos para cubrir todas las muestras y estándares. A continuación, añada 10 microlitros de patrón o muestra a cada uno de los tubos que contengan reactivo.

Mezclar bien mediante un suave vórtice. Incuba los tubos a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, deje que las reacciones se equilibren a temperatura ambiente durante unos 10 minutos.

A diferencia del método de la proteína A dos 80, el método de la proteína BCA requiere que se genere una curva estándar antes de que se puedan medir las concentraciones de proteínas de la muestra. Para generar una curva estándar, comience seleccionando el método de proteína BCA en el menú principal. Si aparece la ventana de verificación de longitud de onda, asegúrese de que el brazo esté hacia abajo.

Introduzca los valores de cada concentración estándar en la tabla del panel derecho. El software permite la referencia y hasta siete estándares adicionales. La referencia y/o los patrones se pueden medir en réplicas.

Establezca un espacio en blanco utilizando el búfer adecuado. El blanco para los ensayos métricos de color generalmente está desionizado. Pipetea dos microlitros de agua en el pedestal inferior y baja el brazo.

Haga clic en blanco. Solo se necesita una pieza en bruto para cubrir todas las mediciones posteriores de la referencia y los estándares. Establezca la referencia pipeteando un Eloqua de dos microlitros de solo reactivo de trabajo y tampón sin proteína en el pedestal inferior.

Baje el brazo y haga clic en medir. En la pestaña de estándares, marque el estándar deseado y pipetee dos microlitros del estándar deseado en el pedestal inferior. Baje el brazo y haga clic en medir.

Repita el proceso para todos los estándares. Para ver la curva estándar, haga clic en ver curva estándar. Una vez que se hayan medido todos los estándares, haga clic en el botón de muestras.

Introduzca el ID de la muestra, cargue dos microlitros de muestra en el pedestal inferior y haga clic en medir. Se debe utilizar una alícuota fresca de dos microlitros de muestra para cada medición. Una vez finalizada la medición, limpie la muestra de los pedestales inferior y superior con una toallita seca de laboratorio.

A continuación, se obtiene el resultado ya que la concentración final de la muestra se calcula automáticamente utilizando la curva estándar. Acabamos de mostrar dos formas de determinar la concentración de proteínas, ya sea mediante una medición directa de dos 80 o mediante un método métrico de color indirecto, cada uno utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000 C de microvolumen. Es todo.

Gracias por mirar.