Evitar osmótica en Caenorhabditis elegans: La función sináptica de dos genes, Orthologues de los Derechos Humanos NRXN1 Y NLGN1, Como candidatos para el autismo

Hola, mi nombre es Manuel Ruiz Rubio aquí en el Departamento de Genética de la Universidad de Córdoba en España. Estamos utilizando la elegancia como una herramienta experimental en el estudio del autismo, aprovechando el sistema nervioso caracterizado por el mundo de tres elegancia. Estamos estudiando un mutante del nematodo, eficaz en genes implicados en la sinapsis neuronal y que se ha relacionado con el autismo.

Las rein regans son moléculas de adhesión a la membrana presentes en la sináptica. La cabeza de C elegance contiene el amfi, un órgano sensorial del nematodo con respuestas mediadoras a diferentes estímulos, incluida la fuerza osmótica. Amfi está formado por 12 neuronas bipo sensoriales relacionadas en altura y una acción terminal INAP.

Dos de estas neuronas, llamadas A SH, derecha e izquierda, son particularmente importantes en la función sensorial osmótica. Detección de reequilibrio soluble en agua con alta resistencia osmótica. Hola, Un vino del río Nan con el método del cielo para medir la evitación osmótica en los mutantes del defecto de la sinapsis de la ance.

Para evaluar las implicaciones de la evitación de la neuro y la neuro alta fuerza osmótica, informamos de la diferente respuesta de C frente a mutantes defectuosos en genes neuroneurales utilizando un método basado en una solución de fructosa de cuatro molares. Llame el día del día, por ejemplo, prepare una solución madre de cuatro molares de fructosa con un 1% de rojo Congo y se disuelva completamente a temperatura ambiente. El anillo anular de un centímetro de diámetro en la placa NGM es una sublínea en el centro del medio sólido.

Usando 15 microlitros de la solución de fructosa roja de cuatro molares. Deje que la fructosa penetre en el acre alrededor de cinco minutos, el experimento debe llevarse a cabo a ciegas. La placa con cada cepa a S ocho debe ser etiquetada por un segundo experimentador.

El SA se realiza utilizando estas marcas que no se piden. Cuando el experimento ha finalizado unas 24 horas antes de que se lleve a cabo la venta, es necesario recoger L cuatro larvas de cada genotipo y transferirlas a la placa AFL NGM que contiene la bacteria E. coli y mantenerla a 20 grados centígrados al día siguiente. El experimento debe iniciarse con adultos jóvenes.

Coloque cada lombriz individual de cada cepa dentro del círculo de reposo y siga a cada animal al ritmo de su respuesta a la barrera de tics. 10 animales de cada cepa y un mínimo de tres experimentos de réplica debemos realizar para obtener un resultado concluyente. Los que evitan el anillo rojo seis veces seguidas se clasifican como normales.

Aquellos que salen del anillo en menos de seis intentos se consideran defectuosos en la sensibilidad de ósmosis, la tensión de control debe usarse en cada SA Bristol y se usan dos animales como controles positivos porque se evitan la barrera del anillo. Las cepas de control responden yendo hacia atrás cuando encuentran una barrera osmótica formada por cuatro molares de fructosa. Las bombas de mutantes neurodeficientes tienen un comportamiento similar a estos con respecto a un tipo de fuerza.

Sin embargo, los mutantes deficientes en NEUR no lograron detectar esta barrera osmótica. Las fuerzas dobles mutantes en diferentes alelos neur y nout recuperados el fenotipo de tipo salvaje respondiendo a la fuerza osmótica para la obtención de gusanos descendentes por interferencia de ARN alimentando colonias aisladas de e coli HD 11 cinco cepas que se han transformado con el vector L 44 40 que contiene un fragmento correspondiente al gen diana. Las bacterias se aíslan en LBA o placa con carbónico al día siguiente.

Elija una colonia de bacterias e inocule el medio líquido LV. Siga creciendo durante unas siete horas con temblores a 37 grados. Observe la caída de este cultivo en una placa NGM con techo carbónico e IPTG y wai durante la noche a temperatura ambiente, permitiendo que las bacterias crezcan y comenzando la inducción de la expresión del fragmento del gen objetivo.

Es necesario utilizar un control positivo y no negativo para la interferencia de ARN. Experimentos de alimentación. El control negativo es igual.

I HT 11 cinco cepas transformadas con el vector TL 44 40. El positivo controla ELI HT 11 de cinco células transformadas con el vector L 44 40 que contiene una secuencia de 22 genes. El bloqueo de este gen se origina en un fenotipo tembloroso fácilmente distinguible bajo el microscopio estéril.

El primer día. L cuatro etapas de NGM PLA con bacterias se transfieren en placa con bacterias y Kuwait a 20 grados Celsius durante 12 horas. Este es un período de ayuno.

Al día siguiente, mueva al adulto joven rápido a una placa inoculada con bacterias que expresan el gen objetivo de interferencia de ARN específico. Dejar unas 48 horas a 20 grados centígrados para obtener la progenie F1. A continuación, elija unas cuantas bombas F1 para adultos en otra placa inoculada con la misma bacteria durante los dos días siguientes.

Seleccionar y aislar a los adultos jóvenes de la progenie F dos Puntuación para los fenotipos Bristol N dos cepas de tipo salvaje grasa con bacterias que ocurren empatía. L 44 40 vector iba hacia atrás cuando estaba bien. La barrera osmótica.

Bristol Y la verdadera cepa de tipo blanco alimentada con bacterias que expresan un fragmento del gen neural de la elegancia no pudo detectar los dedos de los pies para las soluciones molares. Sin embargo, un mutante neur deficiente incapaz de detectar la barrera osmótica recuperó esta capacidad cuando fue alimentado con bacterias que expresaban un fragmento del gen nane procedente de la elegancia marina. En este vídeo, mostramos un método sencillo que permite estudiar el efecto de los genes que afectan a la respuesta de evitación osmótica en la elegancia del mar.

Un anillo de fructosa formal ajustado con rojo Congo se utiliza para analizar la respuesta de la bomba a la fuerza osmótica. La neurología en los mutantes deficientes son defectuosos en esta respuesta, sin embargo, los mutantes NU no se ven afectados para detectar el estrés del tomo mostrando una respuesta similar a la cepa de tipo salvaje. Este video muestra que las cepas dobles mutantes portadoras de diferentes alelos knockout en genes de liberación y recuperación recuperaron el fenotipo de tipo salvaje respondiendo a la fuerza osmótica.

Estas observaciones se confirmaron utilizando el enfoque de bloqueo de alimentación de ARN de interferencia. De esta manera, la cepa de tipo salvaje se vio afectada en el reconocimiento de la barrera osmótica cuando fue alimentada con bacterias que expresan de acuerdo con la secuencia del gen ING. Por otro lado, los mutantes neur defectuosos, que son incapaces de detectar las cuatro soluciones de fructosa más, recuperaron este comportamiento cuando fueron alimentados con bacterias que expresan según la secuencia del gen NNU.

Los resultados mostrados en este experimento indican que n seeing y neur podrían estar involucrados en la conexión sináptica de las neuronas sensoras del nematodo y también que interactúan entre sí de una manera que afecta la función sináptica. Bien, adiós y buena suerte con tus experimentos.