Name: Evitar osmótica en Caenorhabditis elegans: La función sináptica de dos genes, Orthologues de los Derechos Humanos NRXN1 Y NLGN1, Como candidatos para el autismo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende a evaluar la detección de fuerza osmótica en Caenorhabditis elegans mediante ensayos conductuales. Este método estudia mutantes deficientes en neuroligina y neurexina para comprender su función sináptica en neurociencia.

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Nos gustaría que el Dr. Antonio Miranda-Vizuete gracias por su valiosa ayuda. También queremos expresar nuestro agradecimiento a Salma Boulayoune y Caballero de Isabel valiosa asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por una subvención de la Junta de Andalucía (BIO-272). Esta investigación se ha llevado a cabo de acuerdo con las leyes vigentes que rigen la experimentación genética en Europa.

1: ensayo de evitar osmótica. <ol><li> Alrededor de 16-24 horas antes del ensayo, recoger animales L4 etapa larval de cada genotipo a un plato fresco que contiene NGM OP50 E. coli que andincubate a 20 ° C. Al día siguiente, comenzar el experimento con los adultos jóvenes. </li><li> Se recomienda llevar a cabo el ensayo "a ciegas". Las placas con cada cepa a ensayar deben ser etiquetados de nuevo por un segundo experimentador, realizar el ensayo con las placas reetiquetados que ser desenmascarada cuando el experimento ha terminado. </li><li> El día del ensayo, preparar una solución de 4 millones de fructosa con el Congo solución al 1% Red y disolver completamente a temperatura ambiente. Le recomendamos que visite la solución antes de cada ensayo ya que el tinte podría precipitar con el tiempo. </li><li> Anillo anular (1 cm de diámetro) en la placa de NGM se describe en el centro del medio sólido, con 15 l de la solución 4M fructosa rojo. Deje que la solución de fructosa penetre en el agar, esto suele tardar entre 2 y 5 minutos. </li><li> Lugar individual animales adultos jóvenes de cada cepa dentro de la circunvalación y seguir en los próximos 10 minutos para determinar la respuesta a la barrera osmótica. Animales para evitar el anillo de más de seis veces en una fila son clasificados como normales, los que sale el anillo en menos de seis intentos no se consideran defectos en la sensibilidad osmótica. Nota: La cepa de control se deben utilizar en cada ensayo. N2 animales adultos jóvenes se utilizan como controles positivos, ya que de manera decisiva evitar la barrera del ring. Los animales que han sido previamente muerto de hambre, pasó por Dauer larvas o son procedentes de las placas que son demasiado seco no se debe utilizar. Al principio, los animales de control deben ser evaluados por duplicado, para confirmar que las placas de ensayo y la solución es correcta. </li></ol> 2: La generación de gusanos caída por la alimentación de RNAi. <ol><li> RNAi placas: NGM placas de alimentación RNAi contiene por litro: 17 g de agar, 2,5 g de peptona, 3,0 g de NaCl, 1 ml de 5 mg de colesterol ml -1; llenar el frasco de 1 litro con H 2 O y autoclave. Después de agar se enfría a 65 ° C, 25 ml de 1 M KPO 4, pH 6,0, 1 ml de 1 M de CaCl 2, 1 ml de 1 M MgSO 4, 0,5 ml carbenicilina (50 mg ml -1) y 1 ml 1M IPTG. Si usted está comenzando con NGM sólidos preparados, derretir un medio sólido en el microondas y, posteriormente, el lugar NGM líquido en el banco que se enfríe y luego añadir KPO 4, pH 6,0, CaCl2, MgSO 4, carbenicilina y IPTG como se indicó anteriormente. Añadir 10 ml de NGM en cada uno de 60 mm placa de Petri. Permitir el enfriamiento e invertir las placas manteniéndolas durante una noche antes de su uso RT. Las placas pueden guardarse en una bolsa de plástico a 4 ° C durante 4-5 días. </li><li> Preparación de bacterias y de inducción: aislar las colonias de E. coli HT115 (DE3) cepa, transformada con L4440 vector que contiene un fragmento correspondiente al gen diana, en Luria-Bertani (LB) placas de agar (17 g de agar, 10 g de triptona, 5 g extracto de levadura y 10 g de NaCl por litro) que contiene la ampicilina (50 mg / ml) y tetraciclina (15 mg / ml). Elija una colonia de bacterias y se inoculan en LB con 50 mg / ml de ampicilina, y se cultivan durante 6 8 h con agitación a 37 ° C, una caída de la semilla de esta cultura en los platos preparados NGM y secar los platos de fondo antes de incubar durante la noche ( 12 24 h) a temperatura ambiente para permitir que las bacterias para crecer y para comenzar la inducción. La incubación se encontraba en la oscuridad debido a la tetraciclina es sensible a la luz y puede afectar a la variabilidad de los ensayos de RNAi entre las placas. Es necesario el uso de un positivo y un control negativo para los experimentos de alimentación de RNAi. El control positivo es E.coli HT115 células transformadas con el vector L4440 que contiene la secuencia del gen unc-22. La caída de la UNC-22 gen produce una "contracción fenotipo". El control negativo es E. coli HT115 células transformadas con el vector L4440 vacío. </li><li> Manejo de gusano y de puntuación: El primer día, el lugar L4 gusanos etapa de una placa de NGM sembrado con OP50 en placas NGM sin bacterias e incubar a 20 ° C durante 12 horas (en ayunas). Al día siguiente, la transferencia de los jóvenes adultos hermafroditas en ayunas en un plato seedded con la bacteria que expresa el objetivo específico de genes por RNAi. Deja 40-48 horas a 20 ° C para generar plantas de la F1. A continuación, coloque unas cuantas lombrices adultas F1 sobre otra placa de siembra con la misma bacteria. Después de 24-48 horas, seleccionar y aislar a partir de la progenie F2, los adultos jóvenes (vulva completamente formadas que sobresale con pocos huevos) y la puntuación de los fenotipos. Nota: la inducción de RNAi en las neuronas tienen algunas limitaciones debido a las propiedades refractarias del sistema de C elegans nervioso RNAi.. Para superar los problemas de esta ineficiencia en las neuronas que se recomienda el uso de la cepa FRR-3, un fondo extremadamente sensibles a los efectos del ARNi en neuronas 10. En nuestros experimentos no differences se encontraron entre Bristol N2 y cepas FRR-3 de los genes y analizaron el fenotipo. </li></ol> 3: Las cepas utilizadas. El C. elegans cepas utilizadas en este trabajo se muestran en la Tabla 1. Las cepas mutantes se fuera cruzada contra N2 salvajes - tipo al menos cuatro veces para eliminar las mutaciones al azar no deseados que podrían haberse generado durante el protocolo de mutagénesis. . OP50 E coli cepa fue suppliied por Caenorhabditis Centro Genético de la Universidad de Minnesota, EE.UU. E.coli HT115 (DE3) con el plásmido pL4440 llevar NRX-1 (JA: C29A12.5). Y florines-1 (JA: C40C9.5 fragmentos) de genes fueron proporcionados por el Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, España. 4: Los resultados representativos. Resultados ilustrativos están representados en las figuras 1 y 2. Diez animales de cada cepa y un mínimo de tres experimentos se llevaron a cabo réplica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Los experimentos de conducta de evitación osmótica. Las cepas de control y NRX-1 (ok1649 y tm1961) mutantworms V deficiente responder invirtiendo hacia atrás cuando se encuentran con una barrera osmótica (4 millones de fructosa). Florines-1 (ok259 y tm474) mutantes X no detectan esta barrera. Dobles mutantes deficientes en florines-1 y NRX-1, las cepas CRR21 (ok1649; ok259) y VX CRR23 (tm1961; ok259) VX recuperó el fenotipo de tipo salvaje. El * indica diferencias significativas (P ≤ 0,001) por la prueba t de Student, en la respuesta de cada cepa a la N2 Bristol de tipo salvaje por la prueba t-student <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Los experimentos con gusanos caída por la alimentación de RNAi. E.coli HT115 (DE3) transformada con el vector vacío o pL4440 que contiene un fragmento correspondiente a los genes diana NRX-1 o florines-1 se utiliza para alimentar el gusano cepas diferentes. El * indica diferencias significativas (P ≤ 0,001) por la prueba t de Student, en la respuesta de la cepa N2 alimentados con bacterias portadoras del vector pL4440 con un fragmento dirigidas a la florines-1 gen, en comparación con la cepa N2 alimentados con vacío pL4440 vector .

<ol><li>Sudhof, T. C. Nature. 455 (7215), 903-903 (2008).</li>
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</ol>

Neurexinas neuroliginos y realizar un papel esencial en la transmisión sináptica 11 y diferenciación de las conexiones sinápticas 12. Ambas moléculas han sido identificados como genes candidatos para el autismo 13,14. En este video se muestra un método simple que nos permite estudiar el efecto de los genes que afectan la respuesta de evitación osmótica en C. elegans. Mutantes deficientes neuroligina son defectuosos en la detección de la fuerza osmóti...

Tabla 1. C. elegans cepas. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tensión </td><td> Gene </td><td> Alelo </td><td> Fuente </td></tr><tr><td> Bristol N2 </td><td> - </td><td> - </td><td> aCGC </td></tr><tr><td> VC228 </td><td> florines-1 </td><td> ok259 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX00474 </td><td> florines-1 </td><td> tm474 </td><td> bNBP-JAPÓN </td></tr><tr><td> VC1416 </td><td> NRX-1 </td><td> ok1649 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX1961 </td><td> NRX-1 </td><td> tm1961 </td><td> NBP-JAPÓN </td></tr><tr><td> NL2099 </td><td> FRR-3 </td><td> pk1436 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> CRR21 </td><td> NRX-1; florines-1 </td><td> ok1649; ok259 </td><td> Este trabajo </td></tr><tr><td> CRR22 </td><td> NRX-1; florines-1 </td><td> tm1961; ok259 </td><td> Este trabajo </td></tr></tbody></table> a. Caenorhabditis Centro Genético de la Universidad de Minnesota, EE.UU.. b. Proyecto Nacional para la bio-Experimental de Animales &quot;nematodo C. elegans&quot;. Tokio de la Mujer de la Universidad Médica, Japón.

evitar osmótica en caenorhabditis elegans: la función sináptica de dos genes, orthologues de los derechos humanos nrxn1 y nlgn1, como candidatos para el autismo

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexinas y neuroliginos son moléculas de adhesión celular presentes en las sinapsis excitadoras e inhibidoras, y que son necesarios para el correcto funcionamiento de la red neuronal 1. Estas proteínas se encuentran en las membranas presináptica y postsináptica 2. Los estudios en ratones indican que neurexinas y neurologins tienen un papel esencial en la transmisión sináptica 1. Los informes recientes han demostrado que las alteraciones en las conexiones neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso humano puede constituir la base de la etiología de numerosos casos de trastornos del espectro autista 3. Caenorhabditis elegans puede ser utilizado como una herramienta experimental para facilitar el estudio del funcionamiento de los componentes sinápticos, debido a su simplicidad para la experimentación de laboratorio, y dado que su sistema nervioso y el cableado sináptica se ha caracterizado completamente. En C. Elegans NRX-1 y florines-1 genes son ortólogos humanos de NRXN1 y NLGN1 genes que codifican la alfa-neurexin-1 y neuroligin-1 proteínas, respectivamente. En los seres humanos y los nematodos, la organización de neurexinas y neuroliginos es similar en lo que respecta a los dominios funcionales. El jefe del nematodo contiene el amphid, un órgano sensorial de los nematodos, que media las respuestas a diferentes estímulos, incluyendo la fuerza osmótica. El amphid consta de 12 neuronas sensoriales bipolares con dendritas ciliadas y un axón terminal presináptica 4. Dos de estas neuronas, llamada Ashr y ASHL son particularmente importantes en la función sensorial osmótica, detectar soluble en agua, repelentes con una alta resistencia osmótica 5. Las dendritas de estas dos neuronas alargar hasta el extremo de la boca y los axones se extienden hasta el anillo nervioso, donde hacen conexiones sinápticas con otras neuronas para determinar la respuesta de comportamiento 6. Para evaluar las implicaciones de neurexin neuroligin y en la evitación de alta resistencia osmótica, se muestra la diferente respuesta de C. elegans mutantes defectuosos en NRX-1 y florines-1 genes, utilizando un método basado en un anillo de fructosa 4M 7. Los fenotipos de comportamiento se confirmaron mediante clones específicos de RNAi 8. En C. elegans, el dsRNA necesaria para activar el ARNi puede ser administrado por la alimentación de 9. La entrega de dsRNA a través de los alimentos provoca la interferencia del RNAi el gen de interés lo que permite la identificación de los componentes genéticos y las vías de la red.

Neurexinas y neuroliginos son las neuronas de membrana las proteínas de adhesión que realizan funciones esenciales en la diferenciación sináptica y la transmisión. Neuroligina mutantes deficientes de<em&gt; C. elegans</em&gt; Son defectuosos en la detección de la fuerza osmótica, pero cuando, además, contienen una mutación en el gen que codifica neurexin, recuperan el fenotipo de tipo salvaje.

Evitar osmótica en Caenorhabditis elegans: La función sináptica de dos genes, Orthologues de los Derechos Humanos NRXN1 Y NLGN1, Como candidatos para el autismo

Las neurexinas y neuroliginas son moléculas de adhesión celular presentes en las sinapsis excitadoras e inhibidoras, y son necesarias para el funcionamiento correcto de la red neuronal1. Estas proteínas se encuentran en las membranas presinápticas y postsinápticas2. Estudios en ratones indican que las neurexinas y neuroliginas desempeñan un papel esencial en la transmisión sináptica1. Informes recientes han demostrado que la alteración de las conexiones neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso humano podría constituir la base de la etiología de numerosos casos de trastornos del espectro autista3. Caenorhabditis elegans podría utilizarse como herramienta experimental para facilitar el estudio del funcionamiento de los componentes sinápticos, debido a su sencillez para la experimentación de laboratorio y dado que su sistema nervioso y su cableado sináptico han sido plenamente caracterizados. En C. elegans, los genes nrx-1 y nlg-1 son ortólogos de los genes humanos NRXN1 y NLGN1, que codifican las proteínas alfa-neurexina-1 y neuroligina-1, respectivamente. Tanto en humanos como en nematodos, la organización de las neurexinas y neuroliginas es similar en cuanto a sus dominios funcionales. La cabeza del nematodo contiene el anfido, un órgano sensorial del nematodo que media las respuestas a diferentes estímulos, incluida la fuerza osmótica. El anfido está compuesto por 12 neuronas bipolares sensoriales con dendritas ciliadas y un axón terminal presináptico4. Dos de estas neuronas, denominadas ASHR y ASHL, son particularmente importantes en la función sensorial osmótica, ya que detectan repelentes hidrosolubles con una fuerza osmótica elevada5. Las dendritas de estas dos neuronas se prolongan hasta la punta de la boca y los axones se extienden hasta el anillo nervioso, donde establecen conexiones sinápticas con otras neuronas que determinan la respuesta conductual6. Para evaluar las implicaciones de la neurexina y la neuroligina en la evitación de la fuerza osmótica elevada, mostramos la respuesta diferencial de mutantes de C. elegans defectuosos en los genes nrx-1 y nlg-1, utilizando un método basado en un anillo de fructosa 4M7. Los fenotipos conductuales se confirmaron mediante el uso de clones específicos de RNAi8. En C. elegans, el dsRNA necesario para desencadenar la RNAi puede administrarse mediante alimentación9. La entrega de dsRNA a través del alimento induce la interferencia de RNAi del gen de interés, permitiendo así la identificación de los componentes genéticos y las vías de la red.

Hola, mi nombre es Manuel Ruiz Rubio, del Departamento de Genética de la Universidad de Córdoba en España. Estamos utilizando *C. elegans* como herramienta experimental en el estudio del autismo, aprovechando el sistema nervioso completamente caracterizado de este nematodo. Estamos estudiando mutantes del nematodo afectados en genes implicados en la sinapsis neuronal y que se han relacionado con el autismo.Las neureginas son moléculas de adhesión de membrana presentes en la sinapsis. La cabeza de C. elegans contiene el amfídico, un órgano sensorial del nematodo que media respuestas a diferentes estímulos, incluyendo la fuerza osmótica. El amfídico está compuesto por 12 neuronas sensoriales bipolares con dendritas ciliadas y un axón terminal presináptico.Dos de estas neuronas, llamadas ASHR y ASHL, son particularmente importantes en la función sensorial osmótica, ya que detectan repelentes solubles en agua con alta fuerza osmótica. Aquí se presenta un método basado en un anillo de fructosa para medir la evitación osmótica en mutantes del C. elegans con defectos en la sinapsis.Para evaluar las implicaciones de la neurexina y la neuroligina en la evitación de alta fuerza osmótica, informamos la respuesta diferente de C. elegans frente a mutantes defectuosos en los genes nrx-1 y nlg-1 utilizando un método basado en una solución de fructosa cuatro molar. El día del experimento, prepare una solución stock de fructosa cuatro molar con 1% de rojo de Congo y disuélvala completamente a temperatura ambiente. Dibuje un anillo de un centímetro de diámetro sobre la placa de NGM, trazado en el centro del medio sólido.Utilizando 15 microlitros de la solución roja de fructosa cuatro molar. Deje que la fructosa se absorba en el agar durante aproximadamente cinco minutos. El experimento debe realizarse de forma ciega. La placa con cada cepa que se va a analizar debe ser etiquetada por un segundo experimentador.El SA se realiza utilizando estas marcas que se obtienen sin solicitarlas. Cuando el experimento haya terminado, aproximadamente 24 horas antes de llevar a cabo la prueba, es necesario seleccionar cuatro larvas de cada genotipo y transferirlas a una placa AFL NGM que contenga bacterias e coli, manteniéndolas a 20 grados Celsius durante el día siguiente. El experimento debe iniciarse con adultos jóvenes.Coloque un gusano individual de cada cepa dentro del círculo de reposo y siga a cada animal para cronometrar su respuesta al obstáculo de tic. Se deben utilizar 10 animales de cada cepa y realizar al menos tres experimentos por réplica para obtener un resultado concluyente. Aquellos que eviten el anillo rojo seis veces seguidas se clasifican como normales.Aquellos que salen del anillo en menos de seis intentos se consideran defectuosos en el control de la sensibilidad al ósmosis; se debe utilizar una cepa de control en cada SA Bristol, y se emplean dos animales como controles positivos porque evitan la barrera del anillo. Las cepas de control responden moviéndose hacia atrás cuando encuentran una barrera osmótica compuesta por fructosa cuatro molar. Los mutantes deficientes en neuro carecen de un comportamiento similar a estos respecto a un tipo de intensidad.Sin embargo, los mutantes deficientes en NEUR no lograron detectar esta barrera osmótica. Los dobles mutantes en distintos alelos de neur y nlg recuperaron el fenotipo silvestre, respondiendo a la fuerza osmótica para obtener gusanos descendentes. Mediante alimentación con interferencia de ARN, se aíslan colonias de E. coli cepa HD11, una cepa que ha sido transformada con el vector L4440 que contiene un fragmento correspondiente al gen diana. Al día siguiente, las bacterias se aíslan en placas LBA o con canamicina.Seleccione una colonia de bacterias e inocule medio líquido LV. Incube durante aproximadamente siete horas con agitación a 37 grados. Coloque una gota de este cultivo sobre una placa NGM con cubierta de carbonato y IPTG, y espere durante la noche a temperatura ambiente, permitiendo que las bacterias crezcan e inicien la inducción de la expresión del fragmento del gen diana.Es necesario utilizar un control positivo y un control no negativo para el experimento de interferencia por ARN. Experimentos de alimentación. El control negativo es igual.La cepa I HT 11 cinco transformada con el vector TL 44 40. Los controles positivos ELI HT 11 cinco células transformadas con el vector L 44 40 que contiene una secuencia del gen 22. La interrupción de este gen origina un fenotipo de temblor fácilmente distinguible bajo el microscopio estéril.El primer día. Cuatro estadios L1 procedentes de PLA NGM con bacterias se transfieren a una placa con bacterias y Kuwait a 20 grados Celsius durante 12 horas. Este es un período de ayuno.Al día siguiente, transfiera el adulto joven rápido a una placa inoculada con bacterias que expresen el gen específico diana de interferencia por ARN. Incube aproximadamente 48 horas a 20 grados Celsius para obtener la progenie F1. Luego, seleccione algunos adultos F1 y transfiéralos a otra placa inoculada con las mismas bacterias durante los dos días siguientes.Seleccione y aísle adultos jóvenes de la progenie F2, identificando los fenotipos de la cepa silvestre Bristol N2 grasa con bacterias, ocurriendo empatía. El vector L4440 iba hacia atrás cuando estaba bien. La barrera osmótica.La cepa de tipo salvaje Bristol alimentada con bacterias que expresan un fragmento del gen neur de C. elegans no logró detectar las soluciones osmóticas. Sin embargo, el mutante deficiente en neur, incapaz de detectar la barrera osmótica, recuperó esta capacidad cuando se alimentó con bacterias que expresan un fragmento del gen nlg-1 de C. elegans. En este video, mostramos un método sencillo que permite estudiar el efecto de los genes que afectan la respuesta de evitación osmótica en C. elegans.Se utiliza un anillo de fructosa formal apretado con rojo Congo para analizar la respuesta del gusano a la fuerza osmótica. Los mutantes deficientes en neurologina presentan defectos en esta respuesta; sin embargo, los mutantes NU no tienen dificultades para detectar el estrés osmótico, mostrando una respuesta similar a la cepa silvestre. Este video muestra que las cepas dobles mutantes que portan diferentes alelos nulos en los genes de entrada y liberación recuperan el fenotipo de tipo silvestre al responder a la fuerza osmótica.Estas observaciones se confirmaron mediante interferencia de ARN, utilizando un enfoque de silenciamiento por alimentación. De este modo, la cepa silvestre mostró déficits en el reconocimiento de la barrera osmótica cuando se alimentó con bacterias que expresaban la secuencia correspondiente del gen ING. Por otro lado, los mutantes defectivos en neur, que son incapaces de detectar la solución de fructosa más concentrada, recuperaron este comportamiento cuando se alimentaron con bacterias que expresaban la secuencia correspondiente del gen NNU.Los resultados mostrados en este experimento indican que nrx-1 y nlg-1 podrían estar involucrados en la conexión sináptica de las neuronas sensoriales del nematodo y también que interactúan entre sí de una manera que afecta la función sináptica. Bien, adiós y buena suerte con sus experimentos.

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