Mosaico transgénesis pez cebra para la evaluación de secuencias potenciadoras

Hola, soy Erica Kgi del laboratorio de Shannon Fisher en el Departamento de Biología Celular y del Desarrollo de la Universidad de Pensilvania. Soy Chris Weber, también del Fisher Lab. Y yo soy Shannon Fisher.

Hoy te mostraremos un procedimiento para analizar la función de los elementos potenciadores utilizando la transgénesis del pez cebra. Utilizamos este procedimiento para estudiar las regulaciones transcripcionales de genes importantes en el desarrollo esquelético. Así que comencemos.

Para identificar las secuencias no codificantes que rodean a los genes candidatos, utilizamos el algoritmo fast cons, al que se puede acceder como una pista en el navegador del genoma uc SC. Estamos interesados principalmente en los genes expresados durante el desarrollo esquelético, pero el mismo enfoque se puede utilizar para estudiar cualquier gen expresado en el desarrollo temprano. En el ejemplo que se muestra aquí, hemos identificado secuencias conservadas.

En el intervalo que rodea al gen parachoques humano, examinamos todo el intervalo a los genes adyacentes y determinamos un punto de corte de puntuación logarítmica específica de tamaño bajo que corresponde aproximadamente al 5% superior de la secuencia no codificante. Después de seleccionar las secuencias, se deben seleccionar cebadores de ADN para amplificar la región conservada más 30 o más pares de bases en cada lado. Amplifique la región de interés con polimerasa de alta calidad utilizando ADN genómico humano, utilice procedimientos estándar de biología molecular de laboratorio para clonar el producto amplificado en un vector de expresión.

El vector utilizado en este protocolo es PG wc FOS GFPA gateway. Vector de destino. A continuación, se le dice que transponga.

La enzima necesaria para la transposición se transcribe primero in vitro utilizando el kit de máquina M message M de Ambion y el plásmido PGB 600 antes de las inyecciones experimentales. Pruebe la eficacia de cada lote de transpuestas inyectando un potenciador conocido, como los calcetines de ratón. 10 potenciador.

Para prepararse para las inyecciones, extraiga las agujas utilizadas para la microinyección de vidrio capilar de filamento de 1,2 milímetros de diámetro en un extractor de micropipetas Sutter P 97. Utilice un programa que produzca una punta fuerte con un cono afilado para penetrar en los corions intactos con una hoja de afeitar limpia y un portaobjetos de micrómetro. Rompa las puntas a mano bajo un microscopio estereoscópico hasta un diámetro exterior de aproximadamente 15 micrómetros.

Las agujas se pueden almacenar durante un día en un plato de almacenamiento cubierto. Mantenga la población de peces cebra en un ciclo regular de luz y oscuridad con 14 horas de luz en condiciones estándar el día anterior a la realización de microinyecciones. Prepare a los peces para los apareamientos cronometrados en pequeños tanques de cría.

Coloque tres hembras o dos machos por tanque en filas paralelas en la mañana de las microinyecciones, poco después de que comience el ciclo de luz. Combine machos y hembras en un sistema limpio de agua tratada para la producción de huevos. Revise los peces con frecuencia y recoja los huevos a los pocos minutos de la producción para obtener lotes bien sincronizados.

Mantenga la producción de huevos durante dos o tres horas continuando combinando grupos de pescado fresco durante toda la mañana con una pipeta de vidrio de cinco pulgadas y cuarto de diámetro amplio equipada con una bombilla de látex. Clasifique los embriones recolectados en placas de Petri de 60 por 15 milímetros, parcialmente llenas de medio embrionario en grupos de 50 embriones. Marque el tiempo recogido en la tapa de cada plato.

Por cada nidada de embriones recolectados, guarde un plato de 50 embriones para el control no inyectado entre las colecciones de óvulos. Prepare soluciones de inyección frescas mezclando los siguientes ingredientes en un tubo de micro fuge y guárdelas en hielo. Coloque las agujas de inyección en platos de retención y llénelos con 1,5 a dos microlitros de solución inyectable.

Pipeteando gotas de 500 nanolitros en el extremo ancho de cada aguja. El líquido será atraído a la punta a través de la acción capilar. Prepare al menos dos agujas para cada solución inyectable.

Cargue la aguja llena en el portaagujas de mano de una bomba pico neumática o un inyector de presión similar. Configurado y conectado a un tanque de nitrógeno según las instrucciones del fabricante. Calibre los volúmenes de inyección midiendo el diámetro de las gotas expulsadas en el aceite mineral en un portaobjetos micrométrico, normalmente un tiempo de inyección de 120 milisegundos.

Con una presión de 20 CV, produciré una gota de aproximadamente un nanolitro utilizando un microscopio estereoscópico con un aumento de seis a 10x. Sostenga el embrión en su lugar con un par de pinzas finas y empuje la aguja de inyección con presión constante a través del corión hacia la yema de un embrión en la etapa de una célula o dos células tempranas, coloque la punta de la aguja en la yema justo debajo de los blastómeros, expulse aproximadamente un litro de solución inyectable y retire la aguja para cada construcción que inyectemos mayor o igual a 200 embriones después de que se complete la inyección. Clasifique los embriones eliminando los óvulos no fertilizados, los embriones dañados y las inyecciones fallidas o los embriones sin rojo fenol en los blasfemos.

A continuación, incubamos los embriones y el medio embrionario a 28,5 grados centígrados hasta el momento adecuado para las observaciones. A continuación, te mostraremos algunos resultados representativos de los elementos potenciadores que producen patrones específicos de tejido de expresión de GFP en el embrión de pez cebra. Estudiamos los genes que se expresan en el hueso o el cartílago durante.

Este es un ejemplo de un elemento potenciador aguas arriba del gen acan que regula la expresión en el cartílago facial craneal a los tres días después de la fertilización. Aquí hay otro potenciador, esta vez del gen bumper que regula la expresión en las células óseas. A los cinco días de los muchos potenciadores que hemos identificado, encontramos poca correlación entre la localización en relación con el gen y la regulación de la expresión.

Al elegir las secuencias para probar, es importante recordar que un potenciador puede estar a cientos de kilobases aguas arriba o aguas abajo de un gen o en uno de los intrones como se ve en este embrión. Una parte sustancial de las secuencias no parecen regular la expresión específica del tejido. Estos a menudo muestran muy poca fluorescencia o pueden tener algunas células dispersas en dos sitios comunes para la expresión ectópica, la epidermis y el músculo esquelético.

Acabamos de mostrarle cómo identificar posibles elementos potenciadores a través de la conservación de secuencias y probar su función a través de la transgénesis en mosaico en el pez cebra. Al realizar este procedimiento, es importante examinar la calidad de su ADN y ARN para las inyecciones. Además, asegúrese de examinar cuidadosamente todos sus embriones inyectados, especialmente si solo espera la expresión en un pequeño grupo de ventas.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.