Name: Mosaico transgénesis pez cebra para la evaluación de secuencias potenciadoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a analizar elementos potenciadores mediante transgénesis en mosaico en Danio rerio. Este método permite estudiar la regulación transcripcional de genes clave en el desarrollo esquelético.

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Agradecemos a la Sra. Paula Roy para la cría de peces de excelente, y Steve Ekker para el tipo de regalo el plásmido pDB600. Estos estudios fueron financiados por una donación a San Francisco de NHGRI.

1. Selección y la clonación de secuencias conservadas para las pruebas <ol><li> Primero hay que identificar las posibles secuencias reguladoras de las pruebas funcionales. Contamos con la conservación de una secuencia evolutiva como un criterio para seleccionar las secuencias, y la mayoría utilizan a menudo el PhastCons algoritmo, que es accesible como una pista en la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Sin embargo, hay muchos otros algoritmos disponibles para evaluar la secuencia de conservación entre las especies. </li><li> Una vez que hayamos seleccionado a nuestro secuencias, diseño de cebadores para amplificar cada secuencia de ADN genómico. Cebadores deben ser seleccionados para amplificar la región conservada más 30 o más pares de bases a cada lado. </li><li> Para la amplificación de las secuencias seleccionadas se utiliza el sistema de Takara LA TaqTM. Otras polimerasas va a funcionar, pero es importante utilizar una mezcla que incluye una enzima con capacidad de corrección de pruebas, para reducir al mínimo las posibilidades de errores introducidos durante la amplificación. Verificamos el tamaño de amplificación por electroforesis en gel de agarosa. </li><li> Nosotros usamos la PCR 8/GW/TOPO TA Clonación Kit (Invitrogen) para clonar el producto de PCR en un vector de entrada que contiene los sitios attL recombinación, para generar el clon de la entrada de puerta de enlace. La reacción de la clonación es más eficiente con el nuevo producto de la PCR, lo que es mejor para llevar a cabo la clonación en un día de la PCR. Transformación de las cepas se realiza DH5a seguido por la selección resistencia a la espectinomicina. </li><li> Se verifica que el producto de la clonación TA por digestión de ~ 500 ng del plásmido con EcoRI para liberar la pieza, y confirmar el tamaño de la pieza por electroforesis en gel de agarosa. Se recomienda la secuenciación para verificar la secuencia de inserción y orientación; cebadores utilizados para la amplificación también puede ser utilizado para la secuenciación. </li><li> Desde el clon de la entrada, la secuencia no codificadora se conserva transportados por recombinación LR en nuestro vector de puerta de enlace destino listo, pGW_cfosGFP1, con puerta de enlace LR Clonase II de la enzima Mix (Invitrogen). Transformación de las cepas se realiza DH5a seguido por la selección de resistencia a ampicilina. </li><li> Se verifica que el producto de la recombinación LR por la digestión de ~ 500 ng del plásmido con EcoRV para liberar el inserto, y confirmar el tamaño de la pieza por electroforesis en gel de agarosa. Una vez que un clon exacto ha sido identificado, nos preparamos con el ADN del plásmido HiSpeed ​​Qiagen ® Kit Midi plásmido. Estamos más purificar el plásmido con el Kit QIAquick PCR Purificación, de acuerdo a los protocolos del fabricante, y eluir el ADN con 30 l RNasa libre de agua. El plásmido se diluye a una concentración de 125 ng / mL y almacenadas a 4 ° C antes de las inyecciones. </li><li> ARN que codifican funcional Tol2 enzima transposasa se ​​transcribe in vitro de la pDB600 plasmid2. Podemos purificar el plásmido con el Qiagen Midi-Prep kit, y luego alinear 10-20 mg con XbaI. La síntesis de ARNm se lleva a cabo siguiendo el protocolo mMESSAGE mMACHINE Kit (Ambion). </li><li> Nos purifica y precipitar el ARN de acuerdo con las instrucciones del kit. Nos resuspender ARN a una concentración final de ~ 1μg/μl, o 20 l para una sola reacción, en RNasa libre de agua, y cuantificar mediante espectrofotometría UV. Asimismo, se analizan ~ 1 g de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar la transcripción de larga duración. A pesar de un estándar de TAE o TBE gel es adecuado para este análisis, la muestra de amortiguación desnaturalización incluido en el kit de transcripción se debe utilizar de acuerdo a las instrucciones del kit. </li><li> Probamos cada nuevo lote de transposasa de ARN para la eficacia mediante la realización de inyecciones con un conocido plásmido (Figura 1). Tras la verificación, el ARN se divide en pequeñas partes alícuotas y almacenados a -80 ° C, para evitar la descongelación repetida y volver a congelar de alícuotas individuales. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Embrión de pez cebra inyectados con el potenciador del ratón SOX10 como control. (Arriba) imagen campo claro (inferior) de imágenes de fluorescencia de GFP. Cada nuevo lote de transposasa ARN es la prueba de la eficacia. </li></ol> 2. Microinyección de embriones de pez cebra para el análisis de mosaico transgénicos <ol><li> Tiramos las agujas para la microinyección de 1,2 mm de diámetro exterior de vidrio de filamento capilar en un Sutter P-97 Extractor Micropipeta, con un programa diseñado para dar un consejo fuerte, con una inclinación bastante agudo para penetrar coriones intacto. Rompemos las puntas a mano bajo un microscopio estereoscópico a un diámetro exterior de aproximadamente 15 micras, con una cuchilla limpia y un tobogán de micrómetro. Las agujas se puede hacer el día antes de las inyecciones, y se almacena en un plato de explotación objeto de mantener limpio. </li><li> Mantenemos nuestro pez cebra en un ciclo regular oscura luz, con 14 horas de luz, bajo la norma conditions3. El día antes de la realización de microinyecciones, hemos creado la pesca de apareamientos tiempo en los tanques de cría de pequeños, cada uno con un tanque de base, una inserción de ranuras, y una tapa de plástico. Ponemos tres hembras y dos machos por tank en filas paralelas. </li><li> En la mañana de la micro-inyecciones, poco después comienza el ciclo de luz, comenzamos la combinación de hombres y mujeres en la limpieza del sistema de agua tratada para la producción de huevos. Es importante comprobar el pescado con frecuencia, y recoger los huevos en unos pocos minutos de la puesta, para obtener lotes bien sincronizada. La producción de huevos se puede mantener durante dos o tres horas, al continuar combinar nuevos grupos de peces a lo largo de la mañana. </li><li> Con una amplia gama de diámetro, 5 1 / 4 "pipeta Pasteur de vidrio provista de un bulbo de látex, que ordenar los embriones obtenidos en 60 x 15 mm platos Petri, parcialmente lleno de embriones Medium2, en grupos de 50 embriones, y marcar el tiempo de recogida de la tapa de cada plato. </li><li> Una vez que los peces han comenzado a sentar, preparamos una solución nueva inyección mediante la mezcla de lo siguiente en un tubo de microcentrífuga en hielo: <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td></td></tr><tr><td> Transposón plásmido de acciones (125ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Transposasa ARN de acciones (175ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Fenol sangre roja (2% en H 2 O) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNasa libre de agua </td><td> 2.5μl </td></tr></tbody></table> Las agujas de inyección se colocan en la celebración de los platos y cubiertos por pipeteo 500 gotas nl de solución inyectable en el extremo ancho de cada aguja. Después de que el líquido se extrae a la punta por capilaridad, la solución adicional puede ser añadido a un total de 1,5 a 2 l. Nos preparamos por lo menos dos agujas para cada solución de la inyección. </li><li> La aguja llena se carga en la mano porta-agujas de un neumático Pico-bomba o similares en la presión de inyección, configurada y conectada a un tanque de N2 por las instrucciones del fabricante. Nos calibrar el volumen de inyección, midiendo el diámetro de las gotas expulsadas al aceite mineral sobre un portaobjetos de micrómetro. Por lo general, un tiempo de inyección de 120 ms con una presión de 20 psi dará lugar a una gota de aproximadamente 1 nl, pero pequeñas variaciones en la aguja de diámetro afectará a estos parámetros y calibración puede ser necesaria entre las agujas. </li><li> Las inyecciones se realizan bajo un microscopio estereoscópico a las 6-10X de aumento. Nosotros usamos un par de pinzas finas para retener el embrión en su lugar, introducir la aguja de la inyección con una presión constante a través del corion y en la yema de un embrión en la celda de uno o dos primeras etapas de la célula. Lo ideal es que la posición de la punta de la aguja en la yema justo por debajo de los blastómeros. Aproximadamente 1 nl de solución inyectable es expulsado y se retira la aguja. Para construir cada uno se inyecta ≥ 200 embriones. También es muy importante, para cada nidada de embriones, para salvar a un plato de control de los embriones inyectados. </li><li> Después de las inyecciones que se han completado ordenar los embriones mediante la eliminación de huevos no fecundados, embriones dañados, y las inyecciones no (embriones sin rojo de fenol en blastómeros). A continuación, se incuban los embriones en un medio de embrión a 28,5 ° C hasta el momento apropiado para la observación. </li></ol> 3. Análisis de patrones de expresión del mosaico <ol><li> Después de un tiempo de incubación adecuado, se examinan los embriones inyectados por fluorescencia. El tiempo dependerá del patrón de expresión normal del gen del pez cebra endógena, pero generalmente se ven todos los días durante los primeros 5 días después de la fecundación. </li><li> Se examinan los embriones de fluorescencia en un macroscopio Olympus MVX10 equipado para epifluorescencia, pero cualquier microscopio capaz de obtener imágenes similares bajo consumo de energía va a funcionar. Si hay un gran número de embriones que mueren o un desarrollo anormal en el primer día, mira los controles no inyectados para que el embrague para ver si se ven normales. Si los controles de aspecto normal, el problema más común es la pureza insuficiente del ADN inyectado. Además, los embriones en las primeras etapas son sensibles a la cantidad total de plásmido se inyecta, por lo que es posible que la cuantificación es inexacta y el ADN se inyecta demasiado. </li><li> Al examinar los embriones, tenga en cuenta que todos ellos serán de mosaico para la construcción de inyección. Será necesario examinar cuidadosamente todos los embriones, sobre todo si el dominio esperado de expresión es pequeño. También recuerda que la expresión puede ser dinámico, fuerte fluorescencia en el día 1 podrían desaparecer para el día 2, y los embriones negativos para la expresión de los 3 primeros días podrían mostrar algo en el día 4. </li><li> Hemos escogido algunos embriones con la expresión más amplia, y el uso de estos para documentar el patrón de fluorescencia por photomicroscopy. Después de 5 días de observaciones, los embriones deben ser devueltos a las instalaciones y se crió en una población. En varios meses, los adultos pueden ser examinados para la transmisión de la línea germinal de los transgenes. </li></ol> 4. Resultados Vemos una gran variedad de los patrones y los niveles de expresión, según el elemento potenciador que se analiza. Por lo general estamos muy interesados ​​en los patrones de expresión específica de tejido, y con frecuencia se centra en los genes expresados ​​en el esqueleto. y con frecuencia se centra en los genes expresados ​​en el esqueleto. La figura 2 muestra ejemplos de los patrones de expresión de mosaico que hemos observado en nuestros embriones inyectados, con potenciadores de regulación de la expresión en el cartílago y el hueso. Finalmente, una parte sustancial de las secuencias de prueba no regulan la expresión específica de tejido. Para estos, la mayoría ven a menudo fluorescencia muy poco, tal vez unas pocas células esparcidas por embrión. Con menos frecuencia, podríamos ver la fluorescencia, pero sólo en dos sitios comunes para la expresión ectópica, la epidermis y el músculo esquelético (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ejemplo de patrones de expresión de cartílago y hueso observados en los embriones inyectados. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Hay poca correlación entre la ubicación de la relación potenciador de la regulación de genes y de expresión. Una parte sustancial de las secuencias de prueba no regulan la expresión específica de tejido. Estos a menudo tienen fluorescencia muy poco, o tener dos sitios comunes para la expresión ectópica: la epidermis y el músculo esquelético. (Arriba) imagen campo claro (abajo) la fluorescencia de GFP de la imagen.

<ol><li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).</li>
<li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).</li>
</ol>

Hemos demostrado el método utilizado en nuestro laboratorio para el análisis eficiente de los potenciadores del potencial uso de la transgénesis de pez cebra. Muy a menudo, se utiliza este método para buscar tejido-específica potenciadores asociados con genes humanos. A pesar de la falta de homología de secuencia más evidente de la época entre los humanos y los peces secuencias no codificantes, nos encontramos con que este enfoque suele tener éxito en la identificación de los potenciadores de los genes de interés para n...

<table><tbody><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara Bio Inc</td><td>RR02M</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonación TA pCR8/GW/TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K2500-20</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla enzimática Gateway LR Clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Células competentes de eficiencia para biblioteca DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>12535-019</td><td></td></tr><tr><td>Células competentes de eficiencia para biblioteca DB3.1</td><td>Invitrogen</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>Kit mMESSAGE mMACHINE</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Kit HiSpeed de midi-plásmidos</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Traccionador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Bomba neumática PicoPump</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr></tbody></table>

mosaico transgénesis pez cebra para la evaluación de secuencias potenciadoras

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

La finalización de la secuencia del genoma humano, junto con la de muchas otras especies, ha puesto de relieve el desafío de atribuir funciones específicas a la no codificación de secuencias. Una de las funciones destacadas llevadas a cabo por la fracción no codificantes del genoma es la de regular la transcripción de genes, sin embargo, no existe ningún método eficaz para predecir ampliamente cis-elementos reguladores de la secuencia primaria del ADN. Hemos desarrollado un protocolo eficaz para evaluar funcionalmente posibles elementos reguladores cis-a través de la transgénesis de pez cebra. Nuestro enfoque ofrece ventajas significativas sobre las técnicas de cultivo celular basada en los genes de desarrollo importantes, ya que proporciona información sobre la regulación genética espacial y temporal. Por el contrario, es más rápido y menos costoso que experimentos similares en ratones transgénicos, y que habitualmente se aplica a las secuencias aisladas del genoma humano. Aquí demostramos nuestro enfoque a la selección de los elementos de prueba sobre la base de la secuencia de conservación y el protocolo para las secuencias de la clonación y la microinyección en embriones de pez cebra.

Demostramos nuestro enfoque a la búsqueda de posibles elementos potenciadores de los genes de desarrollo regulado y la evaluación de su función a través de la transgénesis mosaico de pez cebra.

Mosaico transgénesis pez cebra para la evaluación de secuencias potenciadoras

La secuenciación completa del genoma humano, junto con la de muchas otras especies, ha puesto de relieve el desafío de asignar una función específica a los elementos no...

Hola, soy Erica Kgi del laboratorio de Shannon Fisher en el Departamento de Biología Celular y del Desarrollo de la Universidad de Pensilvania. Soy Chris Weber, también del Laboratorio Fisher. Y yo soy Shannon Fisher.Hoy les mostraremos un procedimiento para analizar la función de elementos potenciadores utilizando la transgénesis en pez cebra. Utilizamos este procedimiento para estudiar la regulación transcripcional de genes importantes en el desarrollo esquelético. Así que comencemos.Para identificar secuencias no codificantes que rodean genes candidatos, utilizamos el algoritmo fast cons, que está disponible como una pista en el navegador del genoma uc SC. Nuestro principal interés radica en los genes expresados durante el desarrollo esquelético, aunque el mismo enfoque puede emplearse para estudiar cualquier gen expresado durante el desarrollo temprano. En el ejemplo mostrado aquí, hemos identificado secuencias conservadas.En el intervalo que rodea al gen humano bumper, examinamos todo el intervalo hasta los genes adyacentes y determinamos un valor umbral bajo del logaritmo del puntaje específico para el tamaño, correspondiente aproximadamente al 5 % superior de la secuencia no codificante. Tras seleccionar las secuencias, diseñe cebadores utilizando primer three para amplificar cada secuencia a partir del ADN genómico humano; los cebadores deben elegirse para amplificar la región conservada más 30 o más pares de bases en cada extremo. Amplifique la región de interés con una polimerasa de alta calidad utilizando ADN genómico humano, y emplee procedimientos estándar de biología molecular en el laboratorio para clonar el producto amplificado en un vector de expresión.El vector utilizado en este protocolo es PG wc FOS GFPA gateway. Vector de destino. Después de la creación del vector, indicado para transponer.La enzima necesaria para la transposición se transcribe primero in vitro utilizando el kit M message M machine de Ambion y el plásmido PGB 600 antes de las inyecciones experimentales. Pruebe la eficacia de cada lote de transposas inyectando junto con un potenciador conocido, como el mouse socks. 10 potenciador.Para prepararse para las inyecciones, estire las agujas utilizadas para microinyección a partir de vidrio capilar de filamento con diámetro externo de 1,2 milímetros en un estirador de micropipetas Sutter P-97. Utilice un programa que produzca una punta resistente con una conicidad aguda para penetrar los coriones intactos con una hoja de afeitar limpia y una regla micrométrica. Rompa las puntas manualmente bajo un microscopio estereoscópico hasta un diámetro externo de aproximadamente 15 micrómetros.Las agujas pueden almacenarse durante un día en un recipiente cubierto. Mantenga la población de peces cebra en un ciclo regular de luz-oscuridad con 14 horas de luz bajo condiciones estándar el día anterior a realizar las microinyecciones. Prepare los peces para apareamientos programados en pequeños tanques de cría.Coloque tres hembras o dos machos por tanque en filas paralelas en la mañana de las microinyecciones, poco después de que comience el ciclo de luz. Combine machos y hembras en agua tratada del sistema limpio para la producción de huevos. Revise los peces con frecuencia y recoja los huevos dentro de los pocos minutos posteriores a su producción para obtener lotes bien sincronizados.Mantenga la producción de huevos durante dos a tres horas combinando continuamente grupos frescos de peces durante la mañana con una pipeta de vidrio de cinco y un cuarto de pulgada de diámetro interno, equipada con una perilla de látex. Ordene los embriones recolectados en placas de Petri de 60 por 15 milímetros, parcialmente llenas con medio para embriones, en grupos de 50 embriones. Marque la hora de recolección en la tapa de cada placa.Para cada postura de embriones recolectada, guarde un plato con 50 embriones como control no inyectado entre las recolecciones de huevos. Prepare soluciones de inyección frescas mezclando los siguientes ingredientes en un tubo microcéntrifugo y almacénelas sobre hielo. Coloque las agujas de inyección en platos portadores y llénelas con 1,5 a dos microlitros de solución de inyección.Mediante la pipetación de gotas de 500 nanolitros sobre el extremo ancho de cada aguja. El líquido será arrastrado hacia la punta por acción capilar. Prepare al menos dos agujas para cada solución de inyección.Cargue la aguja llena en el portador manual de agujas de una bomba pico neumática o un inyector de presión similar. Configure y conecte al tanque de nitrógeno según las instrucciones del fabricante. Calibre los volúmenes de inyección midiendo el diámetro de las gotas expulsadas en aceite mineral sobre un portaobjetos micrométrico, normalmente con un tiempo de inyección de 120 milisegundos.Con una presión de 20 PS, obtendré una gota de aproximadamente un nanolitro utilizando un microscopio estereoscópico con un aumento de seis a 10 veces. Sujete el embrión en su lugar con un par de pinzas finas y empuje la aguja de inyección con presión constante a través del corion hasta el vitelo de un embrión en la etapa de una célula o de dos células temprana, coloque la punta de la aguja en el vitelo justo debajo de los blastómeros, expulse aproximadamente un nanolitro de solución de inyección y retire la aguja. Para cada construcción, inyecto más de 200 embriones o un número igual a este. Seleccione los embriones eliminando los huevos no fertilizados, los embriones dañados, las inyecciones fallidas o los embriones sin rojo de fenol en los blastómeros.A continuación, incubamos los embriones y el medio embrionario a 28,5 grados Celsius hasta el momento adecuado para las observaciones. Ahora mostraremos algunos resultados representativos de elementos potenciadores que producen patrones específicos de tejido en la expresión de GFP en el embrión de pez cebra. Estudiamos genes expresados en hueso o cartílago durante.Aquí hay un ejemplo de un elemento potenciador ubicado aguas arriba del gen acan que regula la expresión en el cartílago facial craneal a los tres días post fertilización. Aquí hay otro potenciador, esta vez del gen bumper, que regula la expresión en células óseas. A los cinco días, entre los muchos potenciadores que hemos identificado, encontramos poca correlación entre la ubicación relativa respecto al gen y la regulación de la expresión.Al elegir las secuencias para probar, es importante recordar que un potenciador puede ubicarse a cientos de kilobases hacia arriba o hacia abajo respecto a un gen o dentro de uno de los intrones, como se observa en este embrión. Una porción considerable de secuencias no parece regular la expresión específica de tejido. Estas a menudo muestran muy poca fluorescencia o pueden presentar algunas células dispersas en dos sitios comunes de expresión ectópica: el epitelio y el músculo esquelético.Acabamos de mostrarle cómo identificar elementos potenciadores mediante la conservación de secuencias y probar su función mediante transgénesis Mosaic en pez cebra. Al realizar este procedimiento, es importante examinar cuidadosamente la calidad del ADN y ARN destinados a las inyecciones. Asimismo, asegúrese de analizar minuciosamente todos los embriones inyectados, especialmente si solo espera expresión en un pequeño grupo de células.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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