Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra
29 de septiembre de 2013
Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesis de inserción.
El objetivo general de este procedimiento es producir peces mutantes utilizando la transposición de ruptura de genes en vectores con GAL 4, VP 16 como el principal reportero de trampas de genes. Esto se logra mediante la primera coinyección del vector trampa de genes junto con dos transposiciones altas en embriones de pez cebra. Los embriones inyectados se examinan para detectar la fluorescencia de GFP a los tres días después de la fertilización y se selecciona aproximadamente el 30% de los embriones más brillantes para establecer el grupo F cero.
A continuación, los peces F cero se cruzan con la línea de prueba U-A-S-M-R-F-P para detectar la transmisión de la línea germinal de eventos de trampa génica. El paso final es cruzar la F1 para establecer la generación F dos y generar embriones para la caracterización molecular de eventos de trampas génicas mediante PCR inversa y cinco razas principales. En última instancia, aproximadamente uno de cada 10 peces F cero cribados debería producir progenie de trampas genéticas.
Los transpos que rompen genes se diseñaron para no producir mutaciones al integrarse en las entradas de los genes que codifican proteínas. Nuestros vectores GBT utilizan G 4 P 16 como principal indicador de trampas genéticas. Esta modificación aumenta la sensibilidad para los genes expresados en niveles bajos y hace posible que utilicemos mutantes trampa de genes sin evitar en exceso los fenotipos como impulsores G cuatro para la expresión específica de tejidos de otros transgenes.
Creemos que el principal cuello de botella de nuestro método es lograr tasas suficientemente altas de integración de trampas génicas en la línea germinal de peces F cero. En esta demostración, cubriremos varios pasos críticos, la preparación del ADN, la MICROINYECCIÓN y el cribado de F cero. El vector trampa de un gen GBTB utiliza GAL cuatro VP 16 como el principal reportero de trampas de genes.
Se utilizan dos transposiciones mínimas de altura en los extremos para la integración de trampas de genes. Los eventos de trampas genéticas son detectados directamente por un reportero de EGFP bajo el control de 14 X GAL cuatro UAS. Todo el casete de la trampa genética está flanqueado por sitios P de bloqueo directo.
Esto hace que los eventos de trampas génicas sean reversibles mediante la expresión de peines Cree para establecer pruebas de una relación de causalidad entre una integración específica de trampas génicas y un fenotipo observado. Además, el casete U-A-S-E-G-F-P está flanqueado por sitios FRT directos. La inyección de ARNm de peine invertido conducirá a la escisión del casete U-A-S-E-G-F-P, dejando la mutación de la trampa génica sin marcar por la fluorescencia de EGFP y permitiendo su uso en líneas transgénicas que marcan tejidos específicos o eventos de desarrollo mediante fluorescencia de GFP antes de la microinyección.
Preparar la transposición en el ADN y transponer el ARNm. Prepare el ADN del vector de trampa de un gen GBTB. Utilizando un mini kit de preparación estándar y siguiendo el protocolo del fabricante, es esencial incluir el paso de lavado de PB al preparar el ADN.
De lo contrario, el ADN de la mini preparación estará contaminado por ARN, lo que conducirá a la degradación de las transposiciones Mr.NA, diluya el ADN en el agua libre de ARN a 10 nanogramos por microlitro. Para preparar el ARNm de dos transposiciones, primero PT linealizado tres, TS T dos usando xbo uno. A continuación, transcriba el ADN linealizado utilizando un kit de transcripción in vitro de la máquina de mensajes M T three con una modificación.
Agregue 0,5 microlitros de inhibidor de ARN de bloqueo de costilla después de la etapa de tratamiento del ADN, purifique el ARNm utilizando un kit estándar y evalúe la calidad del ARNm transcrito in vitro mediante electroforesis en gel de Agros. Diluya el ARNm en agua libre de ARN a 40 nanogramos por microlitro y almacene como dos alícuotas de microlitros a menos 80 grados Celsius justo antes de la microinyección. Prepare la mezcla de inyección añadiendo ocho microlitros de transposición diluida en el ADN a una alícuota de dos microlitros de ARNm de transposición.
Inyecte tres nanolitros de la mezcla D-N-A-R-N-A en la yema de embriones de pez cebra de una célula utilizando técnicas de microinyección estándar con el objetivo de la interfaz blasfema de la yema. Después de la inyección, ejecute cinco microlitros de solución de inyección sobrante en un gel de aros al 1% para el control de calidad para asegurarse de que el ARNm transpuesto no se haya degradado aproximadamente seis a ocho horas después de la inyección. Retire los embriones no fertilizados y muertos y distribuya los embriones a 60 a 80 por cada 100 milímetros de placa de Petri. Los embriones anormales y muertos se extraen un día después de la fertilización, dos días después de la fertilización y tres días después de la fertilización a los tres días después de la fertilización bajo un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia o un microscopio vertical.
Examinar los embriones y extraer cualquier embrión anormal. Examinar los embriones restantes sin defectos evidentes. Para la fluorescencia de GFP, seleccione los embriones F zero más brillantes y críalos utilizando los procedimientos estándar de cría de pez cebra y cebra en este laboratorio.
Los GBT generalmente se inyectan en líneas con patrones de pigmentación de tipo salvaje o leopardo. Es razonable esperar que entre el 20 y el 30% de los embriones inyectados seleccionados para la cría sobrevivan hasta la edad adulta. La integración del vector trampa de un gen GBTB puede conducir a la expresión de EGFP por dos mecanismos diferentes.
El primero es un verdadero evento de trampa genética. El vector integra en un gen una transcripción de fusión entre los cinco primos de esa transcripción de gen endógeno y el GAL cuatro VP 16 se hace y se traduce en una proteína de fusión que contiene el extremo final de la proteína y recubierta por el gen mutado de inserción y GAL cuatro, VP 16. Esta proteína de fusión se une a las 14 XUAS y activa la transcripción de EGFP.
El segundo evento menos deseable es una trampa potenciadora. El promotor mínimo frente a EGFP cae bajo el control de un potenciador cerca del sitio de integración que conduce a la producción de EGFP en ausencia de GAL cuatro, VP 16. Para distinguir entre estas dos clases de eventos, se hizo una línea transgénica de 14 X-U-A-S-M-R-F-P marcada por GFP cristalino gamma específico del cristalino.
Los eventos de trampa génica se verifican cruzando peces inyectados con GBT con peces U-A-S-M-R-F-P homocigotos y seleccionando la coexpresión de GFP y RFP, lo que solo es posible si se realiza GAL cuatro, VP 16 y se activa U-A-S-M-R-F-P en trans para comenzar el procedimiento de selección de peces F zero, cruce el individuo F zero con peces U-A-S-M-R-F-P homocigotos. Dado que los peces inyectados con GBT tienen patrones de pigmentación de tipo salvaje o de leopardo y la línea homocigota U-A-S-M-R-F-P está en un fondo de latón, los peces F zero se pueden distinguir fácilmente de los peces U-A-S-M-R-F-P, lo que elimina la necesidad de registrar si el F zero que se está examinando era un macho o una hembra, así como los posibles errores resultantes de errores en el registro o la determinación del sexo de cada pez. Al día siguiente.
Regrese los peces U-A-S-M-R-F-P de latón a su tanque. Coloque los peces F zero que dieron embriones en tanques estáticos individuales mientras se recolectan los embriones para su detección, limpieza y transferencia de los embriones recolectados a nuevas placas de Petri en la tarde del día cero. Examinar los embriones para detectar la fluorescencia de GFP y RFP un día después de la fertilización y tres días después de la fertilización.
Extraiga los embriones positivos tanto para GFP como para RFP, clasifíquelos por el patrón de expresión G-F-P-R-F-P. Si se observa más de un patrón en una nidada y levántelos para establecer la generación F1. Tenga en cuenta que los embriones PF 3D que son positivos para GFP pero no para RFP no se extraen, ya que representan eventos de trampa potenciadora.
Cruza el pez F cero que produjo progenie G-F-P-R-F-P positiva nuevamente para obtener un segundo lote de positivos. Los peces F1 se examinan para establecer dos familias F para documentar el patrón de expresión de trampas génicas y para congelar lotes de embriones para la identificación molecular de los loci de trampas génicas. Primero cruza peces F1 individuales con los peces homocigotos U-A-S-M-R-F-P al día siguiente. Coloque los peces F1 que dieron embriones en tanques estáticos individuales mientras los embriones se recolectan para la detección un día después de la fertilización.
Es posible que el etiquetado de RFP aún no haya aparecido, por lo tanto, examine los embriones para detectar la fluorescencia de GFP y extraiga los embriones positivos de GFP a los tres días después de la fertilización, realice la prueba de detección de la fluorescencia de GFP y RFP y extraiga los dobles positivos. A continuación, fotografíe los embriones positivos tanto para GFP como para RFP a los cinco días después de la fertilización en lotes congelados de 20 embriones G-F-P-R-F-P positivos y 20 G-F-P-R-F-P negativos para la identificación de los genes mutados insertados por PCR inversa y cinco razas principales. Criar los embriones G-F-P-R-F-P restantes positivos para establecer la generación F dos en una inyección exitosa.
Al menos el 80% de los embriones inyectados con la mezcla de ARNm de dos transposiciones de ADN de dos transposiciones mostrarán algún grado de fluorescencia GFP. La baja expresión de GFP indica una inyección fallida o una degradación del ARN transpuesto debido a la contaminación de los ARN. Cuando se seleccionan los embriones GFP positivos más brillantes para establecer el grupo F cero, aproximadamente uno de cada 10 peces F cero seleccionados producirá una progenie de trampas genéticas entre los peces F cero de los que se recuperan los eventos de trampas genéticas.
La mayoría transmite un solo evento de trampa génica además de varias transposiciones no expresivas en integraciones. Dado que todo el casete de la trampa de genes está flanqueado por sitios P de bloqueo directo, cualquier mutación de la trampa de genes ilustrada en este diagrama con cuadros azules que representan exones del gen mutado es reversible mediante la expresión de peines de CRE. Estas imágenes muestran la coexpresión de GFP y RFP en el sistema nervioso de la línea de trampa de genes NSF TP seis, la inyección de ARN Cree en embriones N SF TP seis conduce a la pérdida de la expresión de GFP y RFP.
Tenga en cuenta que no hay una reducción de la expresión de GFP en la lente como se esperaba. La mayoría de los procedimientos descritos aquí son aplicables a otros cribados de trampas de genes, así como a los experimentos regulares de transgénesis con TOL dos y otros transposones. La creación de 20 a 30 cruzamientos de F Zero Out a la semana debería resultar en la recuperación de una trampa de genes por semana.
Sin embargo, el procedimiento puede ampliarse fácilmente.
Visión general
Este protocolo describe un método para la mutagénesis por inserción con trampa génica en pez cebra utilizando Gal4-VP16 como el principal informador y GFP/RFP como informantes secundarios. El procedimiento permite la identificación de progenie con trampa génica que coexpresa GFP y RFP, con un proceso de cribado que se puede escalar según el tamaño del laboratorio.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Genética
- Biología del desarrollo
- Modelos transgénicos
Fundamentos
- La mutagénesis por inserción con trampa génica es una técnica utilizada para crear mutaciones en genes específicos.
- Gal4-VP16 sirve como un informador sensible para la expresión génica.
- GFP y RFP se utilizan para visualizar eventos de trampa génica.
- El método tiene como objetivo minimizar mutaciones no deseadas durante la integración.
Propósito del estudio
- Producir pez cebra mutante para el análisis funcional de genes.
- Mejorar la sensibilidad de la detección de la expresión génica.
- Establecer un método confiable de cribado para eventos de trampa génica.
Métodos utilizados
- Co-inyección de vectores de trampa génica y ARNm de transposasa en embriones de pez cebra.
- Cribado para fluorescencia GFP a los tres días post-fertilización.
- Cruzamiento de peces F0 con líneas tester U-A-S-M-R-F-P para verificar la transmisión germinal.
- Cruzamiento cruzado F1 para establecer la generación F2 para la caracterización molecular.
Resultados principales
- Aproximadamente el 30% de los embriones más brillantes fueron seleccionados para un análisis posterior.
- Aproximadamente uno de cada diez peces F0 produjo progenie con trampa génica.
- Los eventos de trampa génica se confirmaron mediante la coexpresión de GFP y RFP.
- Se identificaron mecanismos de integración, incluyendo eventos de trampa génica verdadera y trampa potenciadora.
Conclusiones
- El método genera eficazmente mutantes de pez cebra para estudios de función génica.
- Las altas tasas de integración de trampa génica son cruciales para resultados exitosos.
- Este enfoque permite el marcado reversible de eventos de trampa génica para investigación adicional.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Gene trap insertional mutagenesis in zebrafish enables high-throughput functional annotation of genes in a vertebrate system, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The use of Gal4-VP16 as a primary reporter enhances sensitivity for low-abundance transcripts and allows converted trap lines to serve as tissue-specific drivers for transgene expression, facilitating pathway interrogation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence by linking genotype to tissue-specific phenotypes without relying on overt developmental defects, particularly valuable for genes with redundant or non-essential functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through insertional mutagenesis that tags endogenous gene expression with Gal4-VP16 for sensitive detection.
- Operational Value: Generates reversible gene trap mutations via loxP-flanked cassettes, allowing causal validation of phenotype-genotype relationships through Cre-mediated excision.
- Scientific Value: Supports functional target validation by converting trapped loci into Gal4 drivers to direct expression of effector transgenes in specific tissues, clarifying gene function in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative dual-reporter readouts (GFP/RFP co-expression) to distinguish true gene trap from enhancer trap events, improving assay specificity.
- Operational Value: Establishes a scalable germline transmission pipeline where ~10% of screened F0 founders yield transmissible gene trap alleles, supporting consistent mutant line generation.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening by freezing batches of double-positive embryos for molecular identification of trap loci via inverse PCR and 5' RACE.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Recovers trap mutations in genes encoding nuclear, cytoplasmic, and membrane proteins, ensuring broad target coverage without bias toward nuclear localization.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling F2 intercrosses to document expression patterns and freeze embryos for genotyping, supporting preclinical validation workflows.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing reversible marking of mutations, thus distinguishing causal gene trap integrations from positional effects in phenotypic screens.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early mutagenesis through lead identification, where gene trap lines serve as both mutant alleles and Gal4 drivers for pathway-specific transgene expression, supporting iterative target validation and assay refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tagging endogenous loci with Gal4-VP16 to monitor expression dynamics in vivo during chemical or genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs via GFP/RFP co-expression scoring, enabling standardized comparison of mutant and wild-type conditions across screening campaigns.
- Analytics: Generates molecular readouts (inverse PCR, 5' RACE) that enable precise identification of trapped genes, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving embryos for genotyping and expression analysis, ensuring phenotypic observations are linked to validated genetic lesions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reversible, scalable platform where founder fish can be repeatedly outcrossed to generate F2 families, supporting longitudinal studies and cross-project reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enhancing detection of low-expression genes and enabling tissue-specific transgene expression without requiring phenotypic penetrance.
- Operational Value: Standardizes mutant generation through defined injection ratios, fluorescence-based sorting, and germline transmission screening, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by providing reversible, allele-specific models for target validation, minimizing false positives from insertional artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through allelic series generation and phenotypic deconvolution, supporting go/no-go decisions based on mechanistic evidence rather than phenotypic severity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection, fluorescence screening, and transgenic line maintenance.
- Dependent on functional transposase mRNA and high-purity DNA preparation, including PB wash steps to prevent RNA contamination.
- Necessitates standardized crossing schemes with UAS-mRFP reporter lines to distinguish gene trap from enhancer trap events via co-expression scoring.
- Involves adaptation considerations for genes encoding secreted or membrane proteins, as N-terminal fusions may impair Gal4-VP16 nuclear localization and transcriptional activity.
- Subject to practical limitations in germline transmission efficiency, where optimizing F0 screening and outcrossing frequency impacts mutant recovery rates.
