Gene reventado Usando Gal4 en pez cebra
29 de septiembre de 2013
Este protocolo describe el método de trampa de genes inserción mutagénesis usando Gal4-VP16 como el reportero principal y GFP / RFP como reporteros secundarias en el pez cebra. Aproximadamente uno de cada diez-alta expresión de genes rendimiento pesquero F0 trampa progenie co-expresión de las buenas prácticas agrarias y RFP. El procedimiento de detección se puede escalar fácilmente para adaptarse al tamaño de la pantalla de laboratorio que realice la mutagénesis de inserción.
El objetivo general de este procedimiento es producir peces mutantes utilizando la transposición con ruptura génica en vectores con GAL cuatro, VP 16 como reportero principal de la trampa génica. Esto se logra primero mediante la coinyección del vector de trampa génica junto con la transposasa tall dos en embriones de pez cebra. Los embriones inyectados se analizan en busca de fluorescencia GFP a los tres días post-fecundación y se selecciona aproximadamente el 30 % de los embriones más brillantes para establecer el grupo F cero.
A continuación, los peces F cero se cruzan con la línea de prueba U-A-S-M-R-F-P para seleccionar la transmisión en la línea germinal de los eventos de atrapamiento génico. El paso final consiste en realizar un cruzamiento externo de los F1 para establecer la generación F dos y generar embriones para la caracterización molecular de los eventos de atrapamiento génico mediante PCR inversa y RACE de cinco primas. En última instancia, aproximadamente uno de cada 10 peces F cero analizados debería producir descendencia con atrapamiento génico.
Se diseñaron transposones rompegenes para no producir mutaciones al integrarse en las entradas de genes que codifican proteínas. Nuestros vectores GBT utilizan G cuatro P 16 como reportero principal de trampa génica. Esta modificación aumenta la sensibilidad para genes expresados a bajos niveles y nos permite utilizar mutantes de trampa génica sin sobreexpresar fenotipos, empleando a G cuatro como controladores para la expresión tisular específica de otros transgenes.
Consideramos que el cuello de botella principal de nuestro método radica en lograr tasas suficientemente altas de integración del gen trampa en la línea germinal de los peces F cero. En esta demostración, abordaremos varios pasos críticos: la preparación del ADN, la MICROINYECCIÓN y el cribado de F cero. El vector de gen trampa GBTB uno utiliza GAL cuatro VP 16 como el reportero principal del gen trampa.
Se utilizan vectores mínimos altos con transposones en ambos extremos para la integración del gen atrapador. Los eventos de atrapamiento génico se detectan directamente mediante un reportero EGFP bajo el control de 14 X GAL cuatro UAS. Todo el casete del gen atrapador está flanqueado por sitios directos de P locks.
Esto hace que los eventos de atrapamiento génico sean reversibles mediante la expresión de combs Cree para establecer la prueba de una relación de causalidad entre una integración específica de atrapamiento génico y un fenotipo observado. Además, la casete U-A-S-E-G-F-P está flanqueada por sitios FRT directos. La inyección de ARNm de combs flip provocará la excisión de la casete U-A-S-E-G-F-P, dejando la mutación de atrapamiento génico sin marcar por fluorescencia de EGFP y permitiendo su uso en líneas transgénicas que marcan tejidos específicos o eventos de desarrollo mediante fluorescencia de GFP antes de la microinyección.
Prepare el transposón en el ADN y el ARNm transpuesto. Prepare el ADN del vector de atrapamiento génico GBTB. Utilizando un kit estándar de mini preparación y siguiendo el protocolo del fabricante, es esencial incluir el paso de lavado PB al preparar el ADN.
De lo contrario, el ADN de la mini prep estará contaminado con ARN, lo que conduce a la degradación del ARNm de transposasa. Diluir el ADN en agua libre de ARN a 10 nanogramos por microlitro. Para preparar el ARNm de transposasa Tn5, primero linearizar el plásmido pT3TS-T7 mediante digestión con XboI. A continuación, transcribir el ADN linearizado utilizando un kit de transcripción in vitro MEGAscript T3 con una modificación.
Añada 0,5 µL del inhibidor rib lock de RNAsis después del paso de tratamiento del ADN, purifique el ARNm utilizando un kit estándar y evalúe la calidad del ARNm transcrito in vitro mediante electroforesis en gel de agarosa. Diluya el ARNm en agua libre de ARNasas a 40 nanogramos por µL y almacénelo en alícuotas de 2 µL a -80 °C justo antes de la microinyección. Prepare la mezcla de inyección añadiendo 8 µL de ADN transposasa diluido a una alícuota de 2 µL de ARNm de transposasa.
Injecte tres nanolitros de una mezcla de ADN-ARN en la yema de embriones de pez cebra de una célula utilizando técnicas estándar de microinyección, dirigiéndose a la interfase entre la yema y el blasmodio. Después de la inyección, corra cinco microlitros de la solución sobrante en un gel de agarosa al 1% para control de calidad, con el fin de asegurar que el ARNm transcrito no se ha degradado. Aproximadamente entre seis y ocho horas después de la inyección, retire los embriones no fertilizados y los muertos, y distribuya los embriones a razón de 60 a 80 por placa de Petri de 100 milímetros. Elimine los embriones anormales y muertos a un día, dos días y tres días posteriores a la fertilización, evaluando a los tres días posteriores a la fertilización bajo un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia o un microscopio vertical.
Examine los embriones y retire cualquier embrión anormal. Examine los embriones restantes sin defectos evidentes. Para la fluorescencia de GFP, seleccione los embriones F cero más brillantes y críelos utilizando los procedimientos estándar de cría de pez cebra en este laboratorio.
Los GBT se inyectan generalmente en líneas con patrones de pigmentación de tipo salvaje o leopardo. Es razonable esperar que del 20 al 30 % de los embriones inyectados seleccionados para su cría sobrevivan hasta la edad adulta. La integración del vector de atrapamiento génico GBTB puede conducir a la expresión de EGFP mediante dos mecanismos diferentes.
El primero es un evento real de atrapamiento génico. El vector se integra en un gen, produciendo una transcripción de fusión entre el extremo cinco prima de ese transcrito génico endógeno y GAL cuatro VP16, que se traduce en una proteína de fusión que contiene el extremo carboxilo de la proteína original y fusionada al gen mutado insertado y a GAL cuatro, VP16. Esta proteína de fusión se une a las 14 XUAS y activa la transcripción de EGFP.
El segundo evento menos deseable es un atrapador de potenciadores. El promotor mínimo delante de EGFP queda bajo el control de un potenciador cercano al sitio de integración, lo que lleva a la producción de EGFP en ausencia de GAL cuatro, VP 16. Para distinguir entre estas dos clases de eventos, se generó una línea transgénica 14 X-U-A-S-M-R-F-P marcada con GFP de cristalina gamma específica del cristalino.
Los eventos de atrapamiento génico se verifican cruzando peces inyectados con GBT con peces homocigotos U-A-S-M-R-F-P y analizando la coexpresión de GFP y RFP, lo cual solo es posible si se produce GAL cuatro, VP 16 y activa U-A-S-M-R-F-P en trans para iniciar el procedimiento de cribado de peces F cero. Dado que los peces inyectados con GBT presentan patrones de pigmentación silvestre o leopardo y la línea homocigota U-A-S-M-R-F-P tiene un fondo brass, los peces F cero pueden distinguirse fácilmente de los peces U-A-S-M-R-F-P, eliminando así la necesidad de registrar si el pez F cero analizado era macho o hembra, así como posibles errores derivados de errores en el registro o en la determinación del sexo de cada pez. Al día siguiente.
Devuelva los peces de bronce U-A-S-M-R-F-P a su tanque. Coloque los peces F cero que produjeron embriones en tanques estáticos individuales mientras se recolectan los embriones para la selección limpia y transfiera los embriones recolectados a nuevas placas de Petri por la tarde del día cero. Seleccione los embriones según la fluorescencia GFP y RFP a un día y tres días posteriores a la fertilización.
Extraiga los embriones positivos para GFP y RFP y clasifíquelos según el patrón de expresión G-F-P-R-F-P. Si se observa más de un patrón en una camada, críelos para establecer la generación F1. Tenga en cuenta que los embriones 3D PF que son positivos para GFP pero no para RFP no se extraen, ya que representan eventos de trampa de potenciador.
Cruce nuevamente los peces F cero que produjeron descendencia positiva para G-F-P-R-F-P para obtener un segundo lote de positivos. Los peces F1 se analizan para establecer familias F2 con el fin de documentar el patrón de expresión del gen atrapado y congelar lotes de embriones para la identificación molecular de los loci del gen atrapado. En primer lugar, cruce peces F1 individuales con los peces U-A-S-M-R-F-P homocigotos al día siguiente. Coloque los peces F1 que produjeron embriones en tanques estáticos individuales mientras se recogen los embriones para su análisis a un día post fertilización.
Es posible que la etiqueta RFP aún no haya aparecido, por lo tanto, examine los embriones en busca de fluorescencia GFP y retire los embriones positivos para GFP a los tres días posteriores a la fertilización; luego, examine la fluorescencia de GFP y RFP y retire los embriones doble positivos. A continuación, fotografíe los embriones positivos para GFP y RFP a los cinco días posteriores a la fertilización. Congele lotes de 20 embriones G-F-P-R-F-P positivos y 20 embriones G-F-P-R-F-P negativos para la identificación de genes mutados por inserción mediante PCR inversa y ensayo 5' RACE. Eleve los embriones restantes G-F-P-R-F-P positivos para establecer la generación F2 tras una inyección exitosa.
Al menos el 80 % de los embriones inyectados con la mezcla de ADN del gen atrapador y ARN mensajero de transposasa mostrarán algún grado de fluorescencia GFP. Una baja expresión de GFP indica ya sea una inyección fallida o la degradación del ARN de transposasa debido a contaminación con ARNasas. Cuando se seleccionan los embriones positivos para GFP más brillantes para establecer el grupo F cero, aproximadamente uno de cada 10 peces F cero analizados producirá descendencia con el gen atrapador entre los peces F cero a partir de los cuales se recuperan los eventos de atrapamiento génico.
La mayoría transmite un único evento de atrapamiento génico además de varias integraciones de transposón no expresadas. Dado que todo el casete de atrapamiento génico está flanqueado por sitios directos P, cualquier mutación por atrapamiento génico ilustrada en este diagrama, con cajas azules que representan exones del gen mutado, puede revertirse mediante la expresión de recombinasa CRE. Estas imágenes muestran la coexpresión de GFP y RFP en el sistema nervioso de la línea de atrapamiento génico NSF TP seis; la inyección de ARN de CRE en embriones NSF TP seis conduce a la pérdida de expresión de GFP y RFP.
Téngase en cuenta que no hay reducción de la expresión de GFP en el cristalino, como se esperaba. La mayoría de los procedimientos descritos aquí son aplicables también a otras búsquedas de atrapamiento génico, así como a experimentos regulares de transgénesis con TOL dos y otros transposones mediante el procedimiento de atrapamiento génico descrito aquí. La realización de 20 a 30 cruces F cero hacia fuera por semana debería resultar en el aislamiento de un atrapamiento génico por semana.
Sin embargo, el procedimiento puede aumentar fácilmente de escala.
Descripción general
Este protocolo describe un método para la mutagénesis insertional mediante trampa génica en pez cebra, utilizando Gal4-VP16 como reportero principal y GFP/RFP como reporteros secundarios. El procedimiento permite la identificación de descendencia con trampa génica que expresa simultáneamente GFP y RFP, con un proceso de cribado que puede escalarse según el tamaño del laboratorio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genética
- Biología del desarrollo
- Modelos transgénicos
Antecedentes
- La mutagénesis insertacional por atrapamiento génico es una técnica utilizada para crear mutaciones en genes específicos.
- Gal4-VP16 actúa como un indicador sensible de la expresión génica.
- Se utilizan GFP y RFP para visualizar los eventos de atrapamiento génico.
- El método tiene como objetivo minimizar las mutaciones no deseadas durante la integración.
Objetivo del estudio
- Producir peces cebra mutantes para el análisis funcional de genes.
- Mejorar la sensibilidad de la detección de expresión génica.
- Establecer un método confiable de cribado para eventos de atrapamiento génico.
Métodos Utilizados
- Co-inyección de vectores de trampa génica y ARNm de transposasa en embriones de pez cebra.
- Tamizado de fluorescencia GFP a los tres días post-fecundación.
- Cruce de peces F0 con líneas tester U-A-S-M-R-F-P para verificar la transmisión en la línea germinal.
- Cruce externo de F1 para establecer la generación F2 destinada a la caracterización molecular.
Resultados principales
- Se seleccionaron aproximadamente el 30 % de los embriones más brillantes para análisis posteriores.
- Cerca de uno de cada diez peces F0 produjo descendencia con trampa génica.
- Los eventos de trampa génica se confirmaron mediante la coexpresión de GFP y RFP.
- Se identificaron mecanismos de integración, incluyendo eventos de trampa génica verdadera y trampa de potenciadores.
Conclusiones
- El método genera eficazmente mutantes de pez cebra para estudios de función génica.
- Las altas tasas de integración del atrapador génico son cruciales para obtener resultados exitosos.
- Este enfoque permite la marcación reversible de eventos de atrapamiento génico para investigaciones posteriores.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La mutagénesis insertional mediante atrapamiento génico en pez cebra permite la anotación funcional de genes a gran escala en un sistema vertebrado, apoyando la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. El uso de Gal4-VP16 como reportero principal aumenta la sensibilidad para transcritos de baja abundancia y permite que las líneas de atrapamiento convertidas actúen como conductores específicos de tejidos para la expresión de transgenes, facilitando la interrogación de vías metabólicas y el cribado fenotípico. Este enfoque mejora la confianza predictiva al vincular el genotipo con fenotipos específicos de tejido sin depender de defectos evidentes en el desarrollo, lo cual es particularmente útil para genes con funciones redundantes o no esenciales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de hipótesis terapéuticas mediante mutagénesis insertional que marca la expresión génica endógena con Gal4-VP16 para una detección sensible.
- Valor operativo: Genera mutaciones reversibles de trampa génica mediante casetes flanqueados por loxP, lo que permite la validación causal de las relaciones fenotipo-genotipo mediante la excisión mediada por Cre.
- Valor científico: Apoya la validación funcional de objetivos al convertir loci atrapados en conductores Gal4 para dirigir la expresión de transgenes efectores en tejidos específicos, aclarando la función génica en contextos relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce lecturas cuantitativas duales con reporteros (coexpresión de GFP/RFP) para distinguir eventos reales de trampa génica de eventos de trampa de potenciador, mejorando la especificidad del ensayo.
- Valor operativo: Establece una plataforma escalable de transmisión en la línea germinal en la que aproximadamente el 10 % de los fundadores F0 analizados producen alelos de trampa génica transmisibles, lo que permite la generación constante de líneas mutantes.
- Valor científico: Permite la preparación de sistemas biológicos validados para cribados posteriores mediante la congelación de lotes de embriones doble positivos para la identificación molecular de los loci atrapados mediante PCR inversa y 5' RACE.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Recupera mutaciones por trampa en genes que codifican proteínas nucleares, citoplasmáticas y de membrana, asegurando una cobertura amplia de dianas sin sesgo hacia la localización nuclear.
- Valor operativo: Facilita la continuidad traduccional al permitir cruces F2 para documentar patrones de expresión y congelar embriones para genotipificación, apoyando flujos de trabajo de validación preclínica.
- Valor científico: Promueve la reducción mecanicista de riesgos al permitir la marcación reversible de mutaciones, distinguiendo así las integraciones causales por trampa génica de los efectos posicionales en cribados fenotípicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la mutagénesis inicial hasta la identificación de candidatos, donde las líneas con trampa génica sirven como alelos mutantes y como conductores Gal4 para la expresión transgénica específica de vías, apoyando la validación iterativa de objetivos y el perfeccionamiento de ensayos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al marcar loci endógenos con Gal4-VP16 para monitorear dinámicas de expresión in vivo durante perturbaciones químicas o genéticas.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles y listos para ensayos mediante la puntuación de la coexpresión de GFP/RFP, lo que permite comparaciones estandarizadas entre condiciones mutantes y silvestres en campañas de selección.
- Análisis: Genera lecturas moleculares (PCR inversa, 5' RACE) que permiten la identificación precisa de genes atrapados, apoyando la priorización de dianas basada en datos.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la conservación de embriones para genotipificación y análisis de expresión, asegurando que las observaciones fenotípicas se asocien a lesiones genéticas validadas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reversible y escalable en la que peces fundadores pueden cruzarse repetidamente para generar familias F2, apoyando estudios longitudinales y el intercambio de reactivos entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al mejorar la detección de genes de baja expresión y permitir la expresión tisular específica de transgenes sin requerir penetrancia fenotípica.
- Valor operativo: Estandariza la generación de mutantes mediante ratios definidos de inyección, clasificación basada en fluorescencia y cribado de transmisión germinativa, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en la identificación de candidatos al proporcionar modelos reversibles y específicos de alelo para la validación de dianas, minimizando los falsos positivos derivados de artefactos por inserción.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo mediante la generación de series alélicas y la desconvolución fenotípica, apoyando decisiones de avance o interrupción basadas en evidencia mecanicista en lugar de la severidad fenotípica únicamente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microinyección en pez cebra, cribado de fluorescencia y mantenimiento de líneas transgénicas.
- Depende de ARNm funcional de transposasa y preparación de ADN de alta pureza, incluyendo pasos de lavado con tampón PB para prevenir contaminación con ARN.
- Necesita esquemas de cruzamiento estandarizados con líneas reporteras UAS-mRFP para distinguir eventos de atrapamiento génico de los de atrapamiento de potenciador mediante puntuación de coexpresión.
- Implica consideraciones de adaptación para genes que codifican proteínas secretadas o de membrana, ya que las fusiones en el extremo N pueden afectar la localización nuclear y la actividad transcripcional de Gal4-VP16.
- Está sujeto a limitaciones prácticas en la eficiencia de transmisión germinativa, donde la optimización del cribado en F0 y la frecuencia de retrocruzamientos influye en las tasas de recuperación de mutantes.
