Preparación de muestras para metabolómica: un método para preparar muestras celulares para el perfil de metabolitos

La metabolómica es el estudio para identificar y cuantificar los metabolitos presentes en las células. Para preparar la muestra, comience por sembrar células de cáncer de mama junto con el medio de crecimiento en dos placas etiquetadas como prueba y control. Incubar durante tres días a 37 grados centígrados. Ahora, retire el medio y agregue medio fresco con estradiol en la placa de prueba y medio simple en la placa de control.

El estradiol se une al receptor de estrógeno alfa en las células de cáncer de mama para inducir ciertas expresiones, lo que provoca un cambio en la composición del metabolito. Incube las placas durante el tiempo deseado. Reemplace el medio con solución salina tamponada con fosfato helado o PBS para lavar las células y luego agregue acetona helada. Los reactivos helados detienen la acción de las proteasas y, por lo tanto, evitan la degradación de las proteínas.

Ahora use un raspador para separar las células de las placas y transfiéralas a los tubos con la ayuda de una pipeta. Tome 20 microlitros de esta suspensión celular en un hemocitómetro y cuente el número de células. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que se utilicen para un análisis posterior. En el siguiente protocolo, preparamos muestras de celdas MCF-7 para cromatografía de gases y espectrometría de masas.

Usando células MCF-7 cultivadas de acuerdo con el protocolo de texto, agregue cinco mililitros de 1x PBS helado al plato. A continuación, incline la placa varias veces antes de retirar el PBS. Repita dos veces más, eliminando la mayor cantidad posible de PBS después del último lavado. Agregue 750 microlitros de acetona preenfriada a cada placa y raspe las células, luego combine las celdas de dos placas en un tubo de dos mililitros con hielo.

Para contar las células para la normalización, para cada tratamiento, utilice dos placas adicionales para la cuantificación de células. Luego, para separar las células de las placas, agregue 2 mililitros de tampón HE e incube durante cinco minutos. Mezcle bien las células pipeteando en el tampón HE.

Luego use 20 microlitros de la solución celular en un hemocitómetro para contar el número de células bajo un microscopio. Almacene las muestras a menos 80 grados Celsius antes de utilizar el análisis de espectrometría de masas por cromatografía de gases para identificar y cuantificar los metabolitos. Realizar análisis integradores de acuerdo con el protocolo de texto.