Preparación de la muestra de Mycobacterium tuberculosis Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica

El objetivo de este procedimiento es analizar mycobacterium tuberculosis, extractos libres de células mediante metabolómica por RMN de primer cultivo, y recolectar las células en una etapa adecuada de crecimiento. A continuación, lysa y obtener extractos libres de células para su análisis. Vuelva a suspender los extractos liofilizados en tampón para el análisis de RMN.

Por último, recopile datos de RMN y analice los espectros con software para identificar los metabolitos. En última instancia, el análisis de RMN de Mycobacterium tuberculosis se utiliza para mostrar la conservación de los niveles de metabolitos en varios tratamientos. La metabolómica de RMN se puede aplicar a aspectos clave de la fisiología de Mycobacterium tuberculosis, como importantes vías metabólicas.

Esta comprensión es fundamental para dilucidar los mecanismos de acción y resistencia de los fármacos e identificar nuevos objetivos para el diseño de fármacos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades debido a la incapacidad de manejar todas las muestras exactamente igual, lo que introducirá variaciones y resultados innecesarios de mi laboratorio. Steven Luka, estudiante de posgrado de doctorado, demostrará los procedimientos para manejar las muestras para el procesamiento de RMN Desde mi laboratorio, el gerente del laboratorio de investigación y Robert Fenton, técnico de investigación tres, ahora demostrarán los procedimientos para manejar cultivos de Mycobacterium tuberculosis al realizar M tuberculosis.

La investigación siguió las prácticas de nivel tres de bioseguridad, según lo definido por las directrices institucionales. Aunque las etiquetas de este video dicen microbacterium tuberculosis por consideraciones de bioseguridad, en esta demostración se utilizó la micobacteria no patógena magmática. Comience por descongelar un 50% de glicerol de M tuberculosis en hielo.

Inocular 0,15 mililitros en 110 mililitros de caldo M-A-D-C-T-W en el ER de 250 mililitros y mi matraz hace crecer los cultivos a 37 grados centígrados con agitación a 100 RPM durante aproximadamente seis días. Si no hay antibióticos, se necesitan adiciones alternativas u otros tratamientos. Cosechar los cultivos para los cultivos que requieren tratamientos.

Reserve un Eloqua de 0,5 mililitros en hielo para el cultivo, la valoración y el control de calidad. A continuación, realice el tratamiento deseado y vuelva a colocar los cultivos en el agitador después del período de tiempo de tratamiento. Retire un mililitro y determine el diámetro exterior 600.

Además, reserve una muestra de 0,5 mililitros para cultivo, valoración y control de calidad. Mantenga las celdas en hielo durante todo el protocolo restante. Recolectar las células en cuatro tubos de 50 mililitros por centrifugación después del lavado con 15 mililitros de agua destilada doble helada.

Reese suspende los pellets en alícuotas de 10 mililitros. Extraer dos alícuotas y pellet por centrifugación, luego resuspender el pellet celular en un volumen final de un mililitro de agua bidestilada. Si se desea una suspensión de una sola célula libre de aglomeración, pase las células a través de una aguja de calibre 27.

Proceda tres veces a transferir la suspensión de celdas de un mililitro a una tapa de rosca de dos mililitros que contiene la matriz de lisis B. Coloque el homogeneizador de lisis 24 de preparación rápida dentro de la cabina de bioseguridad. Coloque las muestras en el portamuestras que asegura la placa de retención. A continuación, procese durante 60 segundos a una velocidad de seis metros por segundo.

A continuación, centrifugar las muestras hasta los restos de células de pellets y las células intactas. A continuación, pase el supinato a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras a un tubo estéril para controlar la ausencia de células viables. Placa de 0,1 mililitros de muestra en MADC. Agar-agar.

Congele las muestras en un baño de hielo seco de etanol y guárdelas a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para ser liofilizadas y procesadas en una instalación de RMN. Después de dos meses, revise las placas para verificar la ausencia de unidades formadoras de colonias. Si no se encuentra ningún usuario de FQ, las muestras pueden extraerse del laboratorio BSL 3 para su posterior análisis en una instalación de RMN estándar.

Después de que las muestras se sequen, vuelva a suspender en 0,7 mililitros de tampón de RMN y transfiéralo a una microcentrífuga de tubo durante tres minutos a 13.000 veces. G, retire 0,6 mililitros y transfiéralo a un tubo de RMN de cinco milímetros. A partir del análisis de medios, un bastidor personalizado facilita la carga de múltiples tubos de RMN en spinners a la profundidad correcta.

A continuación, transfiera las muestras al espectrómetro de RMN para insertarlas en el cambiador de muestras A-B-A-C-S one 20. Alternancia entre cultivos no tratados y tratados con medicamentos. La primera muestra debe precargarse en el imán al comienzo de una ejecución automatizada.

Para calibrar el instrumento, optimice la longitud del pulso de 90 grados con una sola muestra y ajuste el instrumento para las muestras restantes. Utilice el icono RMN y la cuña graduada. Automatice la recopilación de datos de bloqueo, cuñas y RMN para cada muestra.

Para un espectro de RMN de hidrógeno 1D uno, seleccione la secuencia de pulso con supresión de agua y escultura de excitación. Establezca un total de 32, 000 puntos de datos, 128 escaneos y 16 escaneos ficticios para un espectro de control de calidad de dos DH uno C 13 hs. Seleccione la secuencia de pulsos.

Seleccione un total de 2048 puntos de datos con anchura de barrido a lo largo de la cota H directa uno y 64 puntos de datos con anchura de barrido a lo largo de la cota C 13 indirecta. También especifique la colección de espectro con 128 escaneos y 16 escaneos ficticios para obtener una buena relación señal/ruido. Un espectro de tuberculosis generó aproximadamente 400 picos, incluyendo 50 metabolitos conocidos.

Por ejemplo, el procesamiento de datos, tal como se detalla en el manuscrito adjunto, produjo este espectro de metabolitos que están directa o indirectamente asociados con la vía de la D alanina. La magnitud de las intensidades máximas es proporcional a las concentraciones de metabolitos presentes en el extracto celular, por lo que las perturbaciones relativas en los metabolitos y las vías metabólicas se pueden cuantificar entre las muestras y los tratamientos. La metabolómica LMR allana el camino para que las investigaciones en el campo de la bacteriología exploren la fisiología y la patogenia en bacterias visuales y microbacterias, otros microorganismos patógenos o no patógenos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar múltiples extractos de células de tuberculosis para la metabolómica de RMN y, lo que es más importante, mantener la consistencia a lo largo de todo el protocolo para obtener resultados confiables.