Name: Preparación de la muestra de Mycobacterium tuberculosis Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende a preparar extractos libres de células de Mycobacterium tuberculosis para estudios de metabolómica por RMN. Este método permite analizar perfiles metabólicos y evaluar efectos de tratamientos en la fisiología bacteriana.

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Los autores desean agradecer a todos los miembros de los laboratorios del Dr. Barletta y Powers Dr. útiles comentarios durante el desarrollo del protocolo. Damos las gracias a Wendy Austin útil para los debates y correcciones del manuscrito. El trabajo que se describe en este manuscrito fue financiado por becas piloto de semillas para cada investigador mencionado anteriormente de la Universidad de Nebraska-Lincoln Center Biología redox (padre subvención # 017675 2P20RR CNRR, D. Becker, PI). Además, agradecemos a la Dra. Ofelia Chacón para el suministro de fondos de la subvención R21 (1R21AI087561-01A1) para suministros de investigación y de apoyo a sueldo parcial Sr. Halouska para estandarizar técnicas de RMN incluyen en esta publicación.

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<li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions%3A+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Un gran número de estudios han analizado los perfiles transcriptomic y proteómicos de M. tuberculosis bajo una variedad de ensayos in vitro e in vivo. 11-16 En última instancia, los cambios en la expresión génica y la actividad enzimática conducen a variaciones en las concentraciones de las pequeñas moléculas de peso molecular. La descripción completa de estos compuestos constituye el metaboloma. Por lo tanto, los efectos de las drogas y las diferentes condiciones de crecim...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> ADC Enriquecimiento </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120 Cambiador de muestras </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RMN Bruker Avance </td><td> Bruker </td><td></td><td> 500 MHz </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> Fracción V </td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga </td><td> Corning </td><td> 430291 </td><td> 50 ml estéril de polipropileno </td></tr><tr><td> Viales criogénicos </td><td> Corning </td><td> 430488 </td><td> 2,0 ml estéril de polipropileno </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> AG Scientific </td><td> C-1189 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> D (+) - Glucosa </td><td> ACROS </td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td> Óxido de deuterio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td> Erlenmeyer Flask </td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td> Base de estéril, planas, policarbonato, 0,22 m tapa de la membrana PTFE con ventilación </td></tr><tr><td> Frasco de Flash Freeze </td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750 ml </td></tr><tr><td> Secador en frío </td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4,5 l de sobremesa </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> GibcoBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> New Brunswick </td><td> Innova 40 </td><td> Benchtop agitador </td></tr><tr><td> Lisis Matriz B </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td> Lisis de la máquina </td><td> MP Biomedicals </td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R </td><td> Benchtop </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 caldo </td><td> Difco </td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de RMN </td><td> Norell </td><td> ST500-7 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> El enriquecimiento OADC </td><td> BD BBL Middlebrook </td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido Oleico </td><td> Sigma </td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potasio dibásico </td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico </td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td> Rotor - Microfuge 22R </td><td> Beckman Coulter </td><td> F241.5P </td><td> Sellado y polipropileno </td></tr><tr><td> Rotor - Allegra X-15R</td><td> Beckman Coulter </td><td> SX4750 </td><td> Con bio-certificados cubiertas </td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 </td><td> Cambridge Isótopos </td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotómetro </td><td> Beckman Coulter </td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td> Cubetas </td><td> Línea de vida </td><td> LS-2410 </td><td> 1,5 ml de poliestireno, 2 lados claros </td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td> Estéril, 3 ml Luer-Lok </td></tr><tr><td> Filtro de jeringa </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td> 0,2 micras acetato de celulosa estéril </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de la muestra de<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; extractos de estudios de resonancia magnética nuclear metabolómica

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis es la principal causa de mortalidad en los seres humanos a escala mundial. La aparición de ambos múltiples (MDR) y ampliamente-(XDR) de las cepas resistentes a los medicamentos amenaza con descarrilar los esfuerzos actuales de control de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar fármacos y vacunas que son más eficaces que los disponibles actualmente. El genoma de M. tuberculosis se conoce desde hace más de 10 años, sin embargo hay importantes lagunas en nuestro conocimiento de la función de los genes y la esencialidad. Muchos estudios han utilizado desde entonces el análisis de la expresión génica a nivel transcriptomic y proteómicos para determinar los efectos de las drogas, oxidantes, y las condiciones de crecimiento en los patrones globales de expresión génica. En última instancia, la respuesta final de estos cambios se refleja en la composición metabólico de la bacteria incluyendo unos pocos miles de productos químicos de bajo peso molecular. Comparando los perfiles metabólicos de tipo salvaje y cepas mutantes, o bien no tratados o treated con un fármaco particular, puede efectivamente permitir la identificación del blanco y puede conducir al desarrollo de nuevos inhibidores con actividad antituberculosa. Del mismo modo, los efectos de dos o más condiciones en el metaboloma también se puede evaluar. Resonancia magnética nuclear (RMN) es una poderosa tecnología que se utiliza para identificar y cuantificar los intermediarios metabólicos. En este protocolo, los procedimientos para la preparación de M. extractos celulares tuberculosis para análisis de RMN se describen metabolómico. Los cultivos de células se cultivan en condiciones apropiadas y contención requerido nivel de bioseguridad 3, 1 recolectadas, y se sometieron a lisis mecánica, manteniendo las temperaturas frías para maximizar la conservación de los metabolitos. Los lisados ​​celulares se recuperó, se filtró esterilizada, y se almacena a temperaturas ultra-bajas. Partes alícuotas de estos extractos celulares se sembraron en agar Middlebrook 7H9 para unidades formadoras de colonias para verificar la ausencia de células viables. Tras dos meses de incubación a 37 ° C, si no vicolonias capaces se observan, las muestras se retiran de la instalación de contención para el procesamiento aguas abajo. Los extractos se liofilizaron, se resuspendieron en tampón deuterado y se inyectó en el instrumento de RMN, la captura de los datos espectroscópicos que se somete después a análisis estadístico. Los procedimientos descritos se pueden aplicar por tanto de una dimensión (1D) de RMN 1 H y de dos dimensiones (2D) 1 H-13 C análisis de RMN. Esta metodología proporciona más fiable identificación de pequeño peso molecular metabolito y análisis cuantitativos más fiables y sensibles de las composiciones de extracto de células metabólicas que los métodos cromatográficos. Las variaciones del procedimiento descrito después de la etapa de lisis celular también se puede adaptar para el análisis proteómico paralelo.

El perfil de metabolómica<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Se determina después de crecimiento en cultivos de caldo. Las condiciones se pueden variar para probar los efectos de los suplementos nutricionales, agentes oxidantes, y agentes contra la tuberculosis en el perfil metabólico de este microorganismo. Procedimiento para la preparación del extracto es aplicable tanto para 1D<sup&gt; 1</sup&gt; H y 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C análisis de RMN.

Preparación de la muestra de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica

Mycobacterium tuberculosis es una de las principales causas de mortalidad en los seres humanos a escala global. El surgimiento de cepas tanto multirresistentes (MDR) como extensamente resistentes (XDR)...

El objetivo de este procedimiento es analizar extractos libres de células de Mycobacterium tuberculosis mediante metabolómica por RMN. Primero, cultive y coseche las células en una etapa adecuada de crecimiento. Luego, lise las células y obtenga los extractos libres de células para su análisis. Resuspenda los extractos liofilizados en tampón para el análisis por RMN.Finalmente, recopile datos de RMN y analice los espectros con software para identificar los metabolitos. En última instancia, el análisis de RMN de Mycobacterium tuberculosis se utiliza para mostrar las preservaciones en los niveles de metabolitos tras diversos tratamientos. La metabolómica por RMN puede aplicarse a aspectos clave de la fisiología de Mycobacterium tuberculosis, como las vías metabólicas importantes.Esta comprensión es fundamental para elucidar los mecanismos de acción y resistencia de los fármacos y para identificar nuevos blancos para el diseño de medicamentos. En general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades debido a la incapacidad para manipular todas las muestras de manera idéntica, lo que introduciría variaciones innecesarias y resultados de mi laboratorio. Steven Luka, estudian

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Resonancia magnética nuclear de desplazamiento puro: una nueva herramienta para la metabolómica de las plantas

En este protocolo, presentamos un flujo de trabajo optimizado, que combina una preparación de muestras eficiente y rápida de muchas muestras. Además, proporcionamos una guía paso a paso para reducir las variaciones analíticas para la evaluación de alto rendimiento de los estudios metabólicos GWAS.

Estudios de asociación multiómica a gran escala de todo el genoma (Mo-GWAS): Directrices para la preparación y normalización de muestras

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Este protocolo separa las proteínas insolubles de la pared celular y la membrana en fracciones simples (1-5 proteínas) utilizando un enfoque isoeléctrico preparativo (IEF) basado en el punto isoeléctrico, seguido de una separación por peso molecular. Las fracciones resultantes se pueden utilizar directamente para análisis inmunológicos y proteómicos sin necesidad de una mayor purificación.

Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

Este protocolo muestra que el batido de perlas combinado con la purificación de perlas de captura de ADN proporciona un método rápido y consistente para extraer ADN de muestras de Mycobacterium tuberculosis , lo que lo convierte en una opción efectiva para aplicaciones de secuenciación de próxima generación.

Extracción de ADN micobacteriano mediante batido de perlas en tampón personalizado seguido de un flujo de trabajo NGS

Este protocolo describe el método CTAB para extraer ADN de alta calidad de micobacterias, superando los desafíos que plantean sus duras paredes celulares ricas en ácido micólico. El proceso implica digestión enzimática, lisis celular con CTAB y purificación del ADN mediante extracción orgánica y precipitación de etanol. Este método produce ADN adecuado para estudios moleculares y es fiable para la investigación micobacteriana.

Extracción de ácido desoxirribonucleico de genoma completo de especies de Mycobacterium mediante la técnica de bromuro de cetiltrimetilatonio

Este estudio optimiza un método de extracción de ARN basado en fenol caliente para Mycobacterium, obteniendo ARN de alta calidad adecuado para análisis transcriptómicos. Al compararlo con TRIzol y RNeasy en condiciones idénticas, el método proporcionó un mayor rendimiento, integridad comparable y una eficiencia de costos mejorada, ofreciendo una alternativa práctica para estudios a gran escala de expresión génica.

Extracción de ARN optimizada basada en fenol caliente de micobacterias: un enfoque robusto para el análisis fiable de la expresión génica

Aprende a preparar extractos libres de células de Mycobacterium tuberculosis para estudios de metabolómica por RMN. Este método permite analizar perfiles metabólicos y evaluar efectos de tratamientos en la fisiología bacteriana.

Preparación de la muestra de

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