Un método para medir el metabolismo en muestras ordenadas subpoblaciones de Comunidades celulares complejas utilizando isótopos estables de Búsquedas

El objetivo general de este método es utilizar el rastreo de isótopos para medir el metabolismo de poblaciones clasificadas de comunidades celulares complejas. Por lo tanto, con este método, podemos estudiar las diferencias metabólicas entre subpoblaciones de comunidades celulares complejas, y también la colaboración metabólica entre esas subpoblaciones. La principal ventaja de esta técnica es que al combinar el rastreo de isótopos con la clasificación de células, podemos obtener una medida más fiable del metabolismo, y también podemos validar la fiabilidad del método.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que combina diferentes técnicas, y la forma en que se manejan las células y la duración del procedimiento pueden afectar el metabolismo celular. Para la extracción de metabolitos de una placa, primero se cultivan células en una placa de seis pocillos en un medio de cultivo marcado con isótopos estables que contiene suplementos dializados. Cuando las células alcancen el 75% de confluencia, enjuague los pocillos dos veces con 500 microlitros de HBSS frío que contenga glucosa marcada uniformemente.

Luego agregue 600 microlitros de metanol preenfriado 100% de hielo seco a cada pocillo y transfiera la placa al hielo seco. Use un raspador de células para separar las células y luego transfiera cuidadosamente los extractos de cada pocillo a tubos de microcentrífuga individuales. Almacene las células a menos 80 grados centígrados hasta el análisis por espectrometría de masas.

Para la extracción de metabolitos de las células clasificadas, se cultivan las células en una placa de 100 milímetros en un medio de cultivo marcado con suplementos dializados, de modo que alcancen el 75% de confluencia el día de la clasificación. Para el marcaje por pulsos de células clasificadas por el ciclo celular, cultive las células en medio no marcado que contenga suplementos dializados hasta que alcancen el 75% de confluencia. A continuación, etiquete las células en pulsos durante dos horas sustituyendo el medio por un medio de cultivo nuevo marcado.

Enjuague el plato con HBSS tibio que contenga glucosa marcada uniformemente y separe las células con 1,5 mililitros de tripsina EDTA a 37 grados centígrados. Después de cuatro minutos, desactive la tripsina con tres mililitros de HBSS helado que contenga glucosa marcada y suplementos dializados, y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender el gránulo en HBSS que contiene glucosa marcada, suplementos dializados y EDTA a una concentración de una a dos veces 10 a seis células por mililitro, y filtre las células a través de un colador de 40 micras para obtener una suspensión de una sola célula.

Transfiera las células a un tubo de cinco mililitros y clasifíquelas en un citómetro de flujo. Para la extracción de metabolitos de células clasificadas simuladamente, retire los desechos y clasifique solo los singletes. Para la extracción de metabolitos de las células clasificadas del ciclo celular, se eliminan los restos y los dobletes, y se clasifican las células en G1 y SG2M, en función de la fluorescencia de la sonda de geminina.

Al final de la clasificación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de agua destilada helada para obtener un pellet homogéneo. A continuación, extraiga rápidamente los metabolitos añadiendo 540 microlitros de metanol refrigerado con hielo seco. Almacene la muestra a menos 80 grados centígrados hasta el análisis LCMS.

La extracción de metabolitos de las células clasificadas debe planificarse con mucha antelación, y el trabajo experimental debe completarse lo más rápido posible para minimizar las alteraciones metabólicas. Para el análisis de los metabolitos extraídos, primero seleccione un número de metabolitos con los correspondientes estándares disponibles que exhiban picos de muestra de buena calidad. A continuación, verifique la calidad de los picos, teniendo cuidado de no incluir isótopos falsos.

Calcule el isótopo de masa de nuestras fracciones para las muestras marcadas con isótopos dividiendo el área de pico de cada isótopo de masa de nuestra fracción por las áreas de pico totales de todos los isótopos de masa de nuestras fracciones. A continuación, calcule las fracciones de carbono marcadas para el enriquecimiento de carbono-13 utilizando la fórmula para el enriquecimiento de carbono. Por último, calcule las fracciones de nitrógeno marcadas para el enriquecimiento de nitrógeno-15 utilizando la fórmula para el enriquecimiento de nitrógeno.

En este experimento representativo, 66 metabolitos seleccionados del análisis de datos estaban presentes en las células clasificadas simuladas, 60 de los cuales parecían estar marcados con isótopos de masa similares de nuestras distribuciones entre los extractos de placas y las células clasificadas simuladas. Por ejemplo, el isótopo de masa de nuestra distribución de glutamato es similar entre los extractos en placa y los extractos clasificados simulados, lo que indica que el isótopo de masa de glutamato de nuestra distribución también es confiable en poblaciones de células clasificadas. El análisis de las células HELA clasificadas en las etapas del ciclo celular G0, G1 o SG2M utilizando la sonda de geminina FUCCI revela el marcaje de citidina en ambas poblaciones con un mayor enriquecimiento en la etapa SG2M, consistente con una mayor síntesis de novo de nucleótidos durante la fase S.

En este experimento, el isótopo de masa de nuestra distribución exhibió el mismo patrón en ambas fracciones ordenadas del ciclo celular, lo que sugiere que se utiliza la misma vía de síntesis, pero es más activa en la etapa SG2M, lo que demuestra que las diferencias metabólicas son fácilmente detectables por este método, incluso entre subpoblaciones estrechamente relacionadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer metabolitos de fracciones clasificadas y comprender las advertencias. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe manipular las células rápidamente durante la clasificación y la extracción de metabolitos, ya que la forma y el tiempo en que se manipulan las células pueden afectar su metabolismo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas. Este procedimiento se puede aplicar a otros tipos de células. Por ejemplo, subconjuntos de células inmunitarias en la sangre, o diferentes tipos de células dentro de un tumor, que usan una variedad de sondas, anticuerpos o métodos de tinción para clasificar.