Aislamiento de CTC a partir de una muestra de sangre completa: un método para obtener CTC a partir de un modelo murino de cáncer colorrectal

- Las células tumorales circulantes, o CTC, son las células cancerosas que se derivan del tumor primario y entran en la circulación sanguínea. La mayoría de las CTC pueden sobrevivir en el torrente sanguíneo sin adherirse a la superficie; Por lo tanto, podemos detectarlos directamente de la sangre de la mayoría de los pacientes con cáncer.

Las CTC en la sangre pueden indicar la propagación del tumor dentro del cuerpo, por lo que identificarlas ayuda a comprender la progresión del cáncer. Comience tomando un modelo de ratón de cáncer colorrectal anestesiado y obtenga sangre por punción cardíaca. Transfiera la sangre a un tubo cónico que contenga medio de gradiente de densidad y centrifugue para separar los componentes de la sangre.

Deseche la capa superior que contiene plasma y recoja la fracción de células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, presente en la interfaz en un tubo separado. A continuación, agregue el anticuerpo anti-EpCAM a las células PBMC y observe bajo un microscopio fluorescente. Las CTC circulantes expresan un marcador celular conocido como molécula de adhesión celular epitelial o EpCAM. Por lo tanto, los anticuerpos anti-EpCAM pueden ayudar a identificar las CTC positivas para EpCAM.

Recoja los CTC y guárdelos para su posterior análisis. En el siguiente protocolo, identificaremos las CTC que expresan EpCAM a partir de la fracción de células mononucleares periféricas de la sangre de un modelo de ratón de cáncer colorrectal.

- Para aislar las células tumorales circulantes en el criterio de valoración experimental adecuado, llene tubos cónicos de 15 mililitros con 5 mililitros de medio de gradiente de densidad por tubo y transfiera cuidadosamente las muestras de sangre completa recolectadas de animales portadores de tumores a las capas de gradiente de densidad.

Separe las células por centrifugación y recupere cuidadosamente la interfaz que contiene las células mononucleares. Pipetear las células mononucleares en un nuevo tubo de 15 mililitros para una segunda centrifugación, seguida de dos lavados en PBS. Después del segundo lavado, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de PBS suplementado con EDTA y agregue cuatro microlitros de anticuerpo anti-EpCAM a cada muestra para una incubación de 20 minutos en hielo en la oscuridad.

A continuación, utilice un bolígrafo de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo de aproximadamente 1 centímetro en una placa de Petri estéril de 6 centímetros por muestra, y añada 700 microlitros de tampón de recogida a cada círculo, seguidos de 50 microlitros de suspensión celular. Use un microscopio para verificar la densidad de las células y deje que las muestras se asienten durante unos cinco minutos. A continuación, examine la gota de células para detectar la positividad de EpCAM y utilice el micromanipulador para transferir las células de interés a 50 microlitros del tampón adecuado para el análisis posterior previsto.