La visualización y cuantificación de interacciones intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos y α-actinina de imagen confocal

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el nivel de colocalización de la bacteria internalizada, RIA Meningitidis, con la proteína del citoesqueleto alfa actinina. Esto se logra infectando células microvasculares del cerebro humano cultivadas con un cultivo nocturno de bacterias durante tres a ocho horas para permitir que las bacterias ingresen a las células objetivo. Como segundo paso, las células con bacterias intracelulares se lavan, se fijan y luego se impregnan, lo que prepara el cultivo infectado para la tinción inmunológica de bacterias internalizadas y alfa actinina intracelular.

Tras la obtención de imágenes confocales y la aplicación de software de colocalización, se pueden observar imágenes de la colocalización intracelular y se obtienen resultados cuantificados que muestran que Meninga Croci expresa OPC y también que la proteína de membrana puede interactuar específicamente con la alfa actinina intracelular basándose en la visualización microscópica confocal y en el análisis cuantitativo de colocalización. Hola, soy Isel Maria del Laboratorio Profesor Mata TI en el Departamento de Medicina Molecular Celular de la Universidad de Bri. Hoy te mostraremos un procedimiento para la estimación del nivel de col, proporción de bacterias intracelulares con proteínas del citoesqueleto.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar una interacción de la meningitis micelial que expresa una proteína de membrana automática OPC con la proteína del citoesqueleto alfa actina. Así que comencemos. Este trabajo debe realizarse en un laboratorio de seguridad adecuado.

Dos días antes del procedimiento de inmunotinción, inocule la tinción bacteriana de interés en la infusión cerebro-corazón. Las placas de agar suplementadas con sangre de caballo calentada al 10% crecen durante la noche a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% el día antes de la inmunotinción. Use un circuito de cultivo de 10 microlitros para hacer una suspensión del cultivo bacteriano durante la noche.

En dos mililitros de PBSB, deje reposar la suspensión durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir que se asienten los agregados bacterianos grandes. A continuación, transfiera el mililitro superior de la suspensión a un tubo estéril sin perturbar el pellet solubilice las bacterias agregando un mililitro de hidróxido de sodio al 1%SDS 0.1 molar a dos viales que contengan 20 microlitros de suspensión bacteriana e invierta el tubo para mezclar. Para estimar el número de bacterias.

Mida el contenido de ácido nucleico determinando la absorbancia de la solución. A las 216 anteras se ajusta la suspensión bacteriana a la densidad requerida en el medio de infección para infectar las células endoteliales microvasculares del cerebro humano. Las células endoteliales microvasculares del cerebro humano, o H-B-M-E-C-A, sembradas dos días antes de la inmunotinción, colocadas en una cubierta de vidrio de 16 milímetros, se deslizan en los pocillos de una placa de 12 pocillos y siembran mares de HBME al 50%Confluencia en las hojas de cubierta, se incuban durante la noche a 37 grados Celsius en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% al día siguiente.

Infecte las células con la suspensión bacteriana recién preparada en nuestro laboratorio. Se utiliza habitualmente una tasa de infección de 200 a 300 unidades formadoras de colonias por célula diana. Incubar durante tres a ocho horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono al final del período de infección.

Lave las células tres veces con PBS y fije 500 microlitros de formaldehído al 2% durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente Después de lavar el formaldehído paraformal, perme las células fijadas en paraldehído incubando en Triton X 100 al 0,1% diluido en PBS durante 10 minutos. Finalmente, lavar las muestras tres veces con PBS y proceder a la inmunotinción como se muestra. La siguiente tinción de bacterias intracelulares y dfor actinina se puede realizar simultáneamente.

En placas de 12 pocillos, bloqueen los cubreobjetos que contienen las células permeables con 500 microlitros de 3%B-S-A-P-B-S-T durante 30 a 60 minutos. A temperatura ambiente después del lavado con transferencia de PBS, cada cubreobjetos a un nuevo pocillo seco en la placa de 12 pocillos en los anticuerpos primarios contra las bacterias y la alfa actinina simultáneamente 80 a 100 microlitros de anticuerpo por cubreobjetos es suficiente si se agrega con cuidado para cubrir la superficie del cubreobjetos, incubar durante una hora a temperatura ambiente Al final de la incubación, agregue 200 microlitros de PBS al pozo, levante el cubreobjetos y colóquelo en un nuevo pocillo que contenga 500 microlitros de PBS Después de cinco minutos, retire el PBS pipeteando y luego agregue PBS fresco. Repita dos veces y transfiera los cubreobjetos a un nuevo pozo seco.

A continuación, añadir los anticuerpos secundarios adecuados conjugados a diferentes fluorocromos diluidos en 1%B-S-A-P-B-S-T Incubar a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad al final de la incubación, se muestra previamente el lavado, luego contratiñir el ADN con DPI durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, al final de esta incubación lavar los cubreobjetos en PBS una vez y luego montar con una gota de montaje. Los cubreobjetos de montaje mediano deben almacenarse en la oscuridad hasta que estén listos para la observación. Bajo el microscopio, observamos y capturamos imágenes de nuestras muestras inmunomarcadas utilizando un microscopio de barrido láser confocal conectado a un microscopio de epifluorescencia invertida.

Para comenzar el procedimiento CLSM con una gota de inmersión en el objetivo y colocar la cubierta del portaobjetos de la muestra, deslizarse sobre la platina del microscopio, configurar el microscopio en un modo visual y encontrar el área de interés utilizando las piezas oculares del microscopio, ahora estamos listos para usar el software Leica. Seleccione el modo de adquisición XY zed. Seleccione el formato de cinco 12 por cinco 12 para los estudios de colocalización.

Cuanto mayor sea la resolución, más precisa será la imagen. A continuación, seleccione el modo X bidireccional, que aumentará la velocidad de escaneo y ayudará a reducir el blanqueo de las fotos. Configure los ajustes de escaneo secuencial.

Haga clic en la función SEC y luego seleccione entre líneas. Seleccione los rayos láser de acuerdo con los fluorocromos conjugados con los anticuerpos secundarios. 4 0 5 nanómetros para DPI 4 88 nanómetros para Alexa, Fluor 4 88 y 5 61 nanómetros.

Para trixy active el tubo fotomultiplicador uno, dos y tres respectivamente. Configure la parte superior e inferior de la pila o serie Z. Siguiente serie, tamaño del paso Zed a 0,2 micrómetros.

RIA Mencius es un diplo occus y, dado que cada caucus tiene un diámetro aproximado de 0,5 micrómetros, un tamaño de paso Z de 0,2 micrómetros aumenta la probabilidad de escanear cada caucus al menos dos veces. Establezca los parámetros de escaneo finales seleccionando el promedio de línea de tres para mejorar la relación señal-ruido haciendo clic en iniciar. Las imágenes teñidas dobles o triples se obtienen mediante escaneo secuencial a diferentes longitudes de onda y utilizando el modo entre líneas para cada canal para eliminar la diafonía entre los diferentes cromóforos.

Para obtener una indicación de la colocalización de dos fluorocromos, seleccione la función de superposición para fusionar los canales seleccionados en una sola imagen. Por ejemplo, cuando tanto Alexa 4 88 como trissy Fluor Chromes co localizan, el color amarillo aparecerá en la imagen superpuesta para una reconstrucción 2D necesaria para visualizar una posible colocalización, compila la pila o serie Zed utilizando la función de proyección máxima. Después de adquirir la pila o serie Z, procese sus datos para obtener una imagen ortogonal para la visualización de la localización intracelular de varios elementos.

La cuantificación de la colocalización se realiza utilizando el software Vol City de IMP provision. Para comenzar a crear una biblioteca con imágenes CLSM, seleccione el enfoque extendido en la imagen en la barra superior. Esta herramienta combinará Zacks en una imagen 2D para ser analizada.

Ahora seleccione la herramienta COLOCALIZACIÓN. Los dos canales a analizar deben tener la misma profundidad de color. Seleccione el área que se va a cuantificar.

Establezca el umbral para eliminar cualquier fondo. Para crear una salida de colocalización, seleccione generar colocalización. Se generarán estadísticas de colocalización para las regiones de interés seleccionadas anteriormente.

A continuación, seleccione los coeficientes R y ny. Por último, la exportación o las estadísticas de los valores a un documento de Excel para la presentación de los datos muestran aquí los resultados de imágenes confocales representativas de las células endoteliales del cerebro humano infectadas con meninga cockeye durante ocho horas. La ubicación de las bacterias se muestra en rojo.

Si bien la ubicación de la alfa actinina se muestra en verde, las flechas indican regiones donde parece haber ocurrido un alto grado de acumulación de alfa actinina alrededor de las bacterias. En esta imagen superpuesta, hay varias regiones en las que aparece un color amarillo anaranjado, lo que sugiere una colocalización entre la meninga occi y la alfa actinina. En la siguiente imagen, la disección óptica de una monocapa de H-B-M-E-C infectada indica la colocalización alrededor de las bacterias intracelulares ubicadas en la base de una célula.

Cuando se procesaron imágenes tridimensionales de monocapas H-B-M-E-C infectadas, una vista oblicua de la superficie apical muestra una bacteria Durant teñida de rojo indicada por la flecha roja donde varias bacterias se localizan hacia las superficies basales de las células endoteliales indicadas por la flecha amarilla. Una ubicación basal de color naranja y amarillo se puede ver más claramente en esta sección transversal del extremo XZ. A diferencia de lo que ocurre hasta ahora, los experimentos con actinina en los que se realizó el marcaje de bacterias internalizadas y mentón o actina revelan una colocalización ocasional con actina, pero una colocalización rara con la fermentación en células H-B-M-E-C.

Como se observó en los experimentos anteriores, Retin se concentró alrededor de varias bacterias internalizadas indicadas por las flechas blancas. Los datos también se analizaron para obtener una superposición relativa. El coeficiente R, que según Manda, representa el verdadero grado de colocalización, es decir, el número de píxeles que se colocalizan en comparación con el número total de píxeles y los valores de NY para alfa actinina, menting y actina en general en H-B-M-E-C infectados con meningococos que expresan OPC, se obtuvo un solapamiento de rienda superior al 25% en un meningococo.

El coeficiente e Y es una medida de la frecuencia de una moneda de la señal de rienda más abundante cada vez que se produce la señal de cacao meninga menos abundante. Esta medida muestra un nivel sorprendente de ocurrencia de alfa actinina en las proximidades del ojo de gallo meninga internalizado. Solo te mostramos cómo visualizar y cuantificar la introducción de bacterias internalizadas con elementos del citoesqueleto dentro de este experimento.

Es importante recordar que hay que seguir estrictamente los protocolos de fijación e inmunidad del tallo para mantener la integridad de las estructuras y evitar un fondo alto. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.