Name: Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende técnicas de microinyección para estudiar la mitosis en embriones sincitiales de Drosophila melanogaster. Este método permite visualizar procesos celulares con alta resolución y comprender la división celular.

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Este protocolo se utiliza actualmente en nuestro laboratorio y ha sido perfeccionado a lo largo de los años por muchas personas como los doctores David Sharp, Kwon Mijung, Sommi Patrizia, Cheerambathur Dhanya. Se agradece al Dr. Bill Sullivan (UCSC), que nos ha proporcionado excelentes consejos sobre la manipulación y la microinyección de los primeros embriones de Drosophila, cuando nuestro trabajo en este sistema se está iniciando (ref. 13). Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Scholey. Nuestro trabajo en la mitosis en Drosophila es apoyado por el NIH subvención GM55507.

Recetas: Placas de jugo de uvas: <ul><li> 5,5 g de agar Bacto </li><li> 14,5 g de dextrosa o glucosa </li><li> 7,15 g de sacarosa </li><li> 45 ml de jugo concentrado de uva (jugo 100%). </li><li> 204.5 ml H 2 0 </li><li> 625 l de NaOH 10N </li></ul> Mezcle todos los ingredientes y horno de microondas hasta que hierva. Añadir la mezcla 2,8 ml de ácido (mezcla de ácidos: 20,9 ml de ácido propiónico, 2,1 ml de ácido fosfórico, 27 ml H 2 0) Mezclar y verter en placas de Petri de 35 mm. Deje que solidifique a temperatura ambiente durante uno o dos días. Si las placas no se va a utilizar muy pronto, sellar con parafilm y se mantenga a 4 ° C (hasta que se estabilice a RT antes de usar). Levadura pasta: Disuelva una cucharadita de levadura (Sigma YSC2, la levadura Saccharomyces cerevisiae de tipo II) en agua para formar una pasta espesa. Coloque una pequeña cantidad de esta en cada placa de jugo de uva antes de su uso. G-PEM buffer: <ul><li> 80 mM Na-TUBOS, pH 6,9 </li><li> MgCl2 1 mM </li><li> 1 mM EGTA </li><li> 1 mM GTP </li></ul> Inyección de tampón: <ul><li> 150 mM K-aspartato </li><li> 10 mM K-fosfato </li><li> 20 mM imidazol, pH 7,2 </li></ul> Heptano cola: Desenrollar cinta adhesiva de doble pegajosa y colocar en un frasco de 100 ml, agregar aproximadamente 50 ml de heptano, el sello de la botella, y el rock durante varios días. Cuando se utiliza, agrega heptano si la cola es demasiado grueso. Cámara de deshidratación: Tome una cápsula de Petri de 100 mm, poner una parte de un plato de 35 mm en el interior para hacer una &quot;mesa&quot; y añadir Drierite (sulfato de calcio anhidro) a su alrededor para que la altura de Drierite no es mayor que la &quot;mesa&quot; y la tapa. El cubreobjetos con embriones se colocan en esta &quot;mesa&quot; para la deshidratación antes de la inyección. Es una buena idea usar al menos algunas Drierite indicando el cambio y que cuando se ha cambiado de color. Protocolo: Este protocolo se puede utilizar para la inyección de casi cualquier reactivo soluble en el embrión de Drosophila sincitial: Por ejemplo, ya sea una proteína fluorescente para la observación o un inhibidor de la proteína diana o ambas cosas. Preparando todo: 1 .- 2 a 3 días antes del experimento, hacer las placas de zumo de uva y establecer laicos jaula: Tome una botella de plástico (6 oz, de fondo redondo de Drosophila Científica Aplicada), corte dos agujeros pequeños (de 1 cm 2) en los lados opuestos de la botella y rellenar con un trozo de algodón (esto permitirá que el aire circule), toque las moscas en la botella y la tapa con una placa de jugo de uva. Mantener a 25 ° C (o temperatura ambiente), las moscas deben establecer los embriones de unos 10 días. 2 .- Por lo menos un día antes del experimento de sacar las agujas para la inyección, se utiliza una aguja Kopf / pipeta modelo de extractor de 720 y delgados filamentos de vidrio de paredes (World Precision Instruments tw100f). Para la inyección de la tubulina fluorescente, mantenga agujas a 4 ° C para evitar que la temperatura inducida por polimerización en la aguja. Tubulina preparación: Nota: Todos los trabajos con la tubulina se debe hacer a 4 ° C para prevenir la polimerización. <ol><li> Tome tubulina marcado fuera del congelador y ponerla en hielo durante 5 a 15 minutos. </li><li> Diluir con el G-PEM buffer (4 a 10 veces dependiendo de la intensidad requerida). </li><li> Se centrifuga a 13k rpm a 4 ° C durante 10-15 minutos. </li><li> Carga 1 a 2 l en la aguja. </li></ol> Anticuerpos o inhibidores químicos: Prepare agujas como para la tubulina, utilizando una concentración adecuada (esto puede ser necesario para ser probado). El anticuerpo puede ser en el buffer de la inyección, el G-PEM buffer o PBS. Si se necesita otro buffer, el buffer tendrá que ser inyectado como un control para asegurarse de que el buffer no causa ningún daño por sí mismo. Nota: Inhibidor de la tubulina y fluorescentes se pueden mezclar e inyectar juntos si las concentraciones lo permiten. De lo contrario, inyectar la tubulina fluorescente y esperar de 5 a 10 minutos antes de la inyección del inhibidor. Cuando se realiza una doble inyección, empieza con más embriones, ya que menos embriones se recuperará con normalidad. De recogida de embriones: <ol><li> Ponga un plato de jugo de uva nuevo en la jaula estaba. </li><li> Eliminar esta placa después de una hora, esta es la primera colección del día y muchas veces no es muy buena. Puede ser descartada. </li><li> Cambiar la placa de cada hora para mantener la recogida de embriones durante una hora cada uno. </li></ol> Cubreobjetos de preparación: <ol><li> Ponga un cubreobjetos de 50 x 22 mm en un lado de un portaobjetos de microscopio. Cinta de las cuatro esquinas de la diapositiva para que no se mueve. </li><li> El uso de un aplicador con punta de algodón, poner una capa de pegamento heptano en una sola línea sobre el cubreobjetos (la cola no debe ser viscoso y se seca en pocos segundos, de lo contrario añadir más heptano). </li><li> Ponga un pedazo dedoble cinta adhesiva en la diapositiva hacia el lado del cubreobjetos. </li></ol> Embrión de la preparación: Nota: Los embriones deben ser reflejados de aproximadamente 2 horas después del inicio de la recolección, a fin de comenzar los siguientes pasos con tiempo suficiente para acabar con ellos dentro de este plazo. <ol><li> Con una brocha humedecida cuidadosamente recoger los embriones de la placa de jugo de uva y el lugar en una cinta adhesiva doble en la diapositiva. </li><li> Utilizando la parte exterior de las pinzas, rollo de los embriones en la cinta adhesiva de doble hasta el corion (la membrana externa) se rompe. </li><li> Levante el embrión suavemente rodando sobre el corion por lo que se pega a la pinza y colocarlo en la cola de heptano en el cubreobjetos con el lado largo del paralelo de embriones para el lado largo del cubreobjetos. Conjunto entre un 10 y 20 embriones en una fila. </li><li> Quitar el cubreobjetos y colocarlo en la cámara de deshidratación de 3 a 8 minutos (esto depende de la humedad de la habitación y la cantidad a inyectar). </li><li> Colocar en una cámara de metal con grasa de vacío. </li><li> Cubrir los embriones con 700 halocarbonos aceite para evitar una mayor deshidratación. Los embriones están listos para la inyección. </li></ol> Embrión de inyección: <ol><li> Buscar los embriones en un objetivo de 16x. </li><li> Mueva los embriones de distancia, y encontrar la aguja sin moverse del plano focal. </li><li> Centro de la aguja y moverla hacia arriba sin moverlo en dirección xo y.. </li><li> Si la aguja no está abierto, puesto al borde del cubreobjetos en el campo de visión, pero no cuando la aguja se va, y bajar la aguja con el mismo plano focal. Con mucho cuidado mover el cubreobjetos hasta que llega la aguja y con cuidado se rompe abierto. Si la aguja está abierto, vaya al paso 5. (Las agujas se pueden abrir con el ácido fluorhídrico antes del llenado). </li><li> Ponga los embriones a la vista (pero no en donde la aguja se), bajar la aguja en el aceite y asegúrese de obtener gotas de buen líquido de la aguja. </li><li> Con cuidado pero sin pausa mover el embrión en la aguja e inyectar una gota en el embrión y mover el embrión de distancia. (O siga las instrucciones de su aparato de inyección). </li><li> Después de todos los embriones se han inyectado, están listos para su observación en un microscopio confocal. </li></ol> Imagen: Imagen de los embriones en un microscopio confocal con un objetivo de 60 o 100 veces: Notas: <ol><li> El intervalo de tiempo en una serie lapso de tiempo debe ser como máximo de unos segundos, ya que la mitosis en el embrión es muy rápido, según el proceso exacto para ser estudiados. </li><li> Una serie en 3D o un solo plano, se pueden adquirir en función del proceso de interés. </li><li> De acción rápida inhibidores de la transferencia del microscopio de inyección de microscopio de imagen tiene que ser rápido. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1: Estudio de la mitosis en el embrión de Drosophila sincitial. Núcleos en el embrión temprano sufren divisiones rápida sin citocinesis, durante los ciclos de 10 a 13 núcleos forman una monocapa en la corteza. A. Esquemática del embrión temprano, con núcleos en la corteza. Embrión puede expresar las buenas prácticas agrarias y / o Solicitud de Propuestas proteínas marcadas y se pueden microinyección con otras proteínas marcadas y / o inhibidores. B. Tiempo de imágenes a intervalos de embriones que expresan GFP-tubulina y el PP-histonas. Parcela C de la separación de Polo-Polo de ciclos de 11 , 12 y 13 en un embrión de tipo silvestre. Longitud de husillo presenta períodos de duración isométrica y los períodos de elongación, que son muy consistentes y reproducibles. D. Dinámica de los microtúbulos del huso. La inyección de baja concentración de tubulina rodamina lleva a manchas formadas por una subunidades de tubulina pocos, que puede ser usado para estudiar la dinámica de los microtúbulos.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
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<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

Este protocolo es relativamente sencillo, sin embargo, cada paso requiere de práctica para asegurarse de que los embriones no están dañados. Cuidadosos experimentos de control siempre se necesita hacer para asegurar que los resultados se están obteniendo fiables. Una buena manera de comenzar es mediante la microinyección de tubulina buffer o rodamina en embriones de control que expresan GFP-tubulina para asegurarse de que la mitosis procede normalmente a través de todos los ciclos en la superficie del embrión (ciclos de...

técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el drosophila melanogaster embrión sincitial

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Este protocolo describe el uso del embrión de Drosophila melanogaster sincitial para el estudio de la mitosis 1. Drosophila tiene una genética útil con un genoma secuenciado, y puede ser fácil de mantener y manipular. Muchos mutantes de mitosis existen, y las moscas transgénicas que expresan funcionales fluorescente (GFP, por ejemplo) - etiquetado proteínas mitótico han estado y están generando. Expresión de genes diana es posible utilizar el sistema GAL4/UAS 2. El embrión de Drosophila temprana lleva a cabo múltiples mitosis muy rápidamente (la duración del ciclo celular, ≈ 10 min). Es muy adecuado para obtener imágenes de la mitosis, ya que durante los ciclos de 10-13, los núcleos se dividen rápidamente y de forma sincrónica sin intervenir citocinesis en la superficie del embrión en una sola monocapa justo debajo de la corteza cerebral. Estos núcleos se dividen rápidamente, probablemente el uso de la maquinaria mitótica igual que otras células, pero que están optimizados para la velocidad, el puesto de control general, se cree que no se estrictas, lo que permite el estudio de las proteínas mitótico cuya ausencia podría causar detención del ciclo celular en células con un control fuerte . Los embriones que expresan proteínas GFP etiquetados o microinyección con la etiqueta fluorescente proteínas pueden ser fácilmente imágenes para seguir la dinámica de vida (Fig. 1). Además, los embriones pueden ser microinyección con el bloqueo de la función-anticuerpos o inhibidores de proteínas específicas para estudiar el efecto de la pérdida o la perturbación de su función 3. Estos reactivos se difunden en todo el embrión, llegando a muchos ejes para producir un gradiente de concentración del inhibidor, lo que a su vez se traduce en un gradiente de defectos comparable a una serie de alelos de mutantes. Idealmente, si la proteína diana es marcado con fluorescencia, el gradiente de inhibición se puede visualizar directamente 4. Se supone que el más fuerte fenotipo es comparable con el fenotipo nulo, a pesar de que es difícil excluir formalmente la posibilidad de que los anticuerpos pueden tener efectos dominantes en raras ocasiones, los controles tan rigurosos y una prudente interpretación debe ser aplicada. Más lejos del sitio de la inyección, la función de proteínas es sólo parcialmente perdido permitir otras funciones de la proteína diana a hacerse evidente.

Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en el<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embrión sincitial para estudiar mitosis.

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

Este protocolo describe el uso del embrión sincitial de Drosophila melanogaster para estudiar la mitosis. Drosophila posee una genética útil con un genoma secuenciado...

Este procedimiento comienza con la recolección de embriones en placas con jugo de uva fresco durante 30 a 60 minutos. Después de retirar la placa de la jaula del lago, recoja los embriones con un pincel humedecido y colóquelos sobre cinta adhesiva doble. Ruede suavemente un embrión sobre la cinta utilizando una mitad de una pinza hasta que el corion se abra.Recoge el embrión y colócalo suavemente sobre la cubierta. Coloca una capa de pegamento het encima. Repite este procedimiento hasta que tengas suficientes embriones.Tras la deshidratación, los embriones están listos para la inyección. Hola, soy Ingrid Bruce Musher del laboratorio del Dr. Jonathan Sculley en el Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de California en Davis. Hoy les mostraremos un procedimiento para microinyectar embriones sincitiales de Drosophila.Utilizamos este procedimiento para estudiar el papel de los microtúbulos y los motores basados en miosina en la mitosis. Por ejemplo, inyectamos microscópicamente anticuerpos u otros inhibidores de proteínas mitóticas específicas. Al analizar el efecto del inhibidor sobre la mitosis, podemos determinar la función de las proteínas diana.Así que comencemos. Para iniciar los preparativos dos o tres días antes del experimento, prepare la jaula de puesta cortando dos orificios pequeños de aproximadamente un centímetro cuadrado en lados opuestos de una botella de plástico. Rellene los orificios con un trozo de algodón, permitiendo que circule el aire.Toque la botella para hacer caer las moscas y luego cúbrala con una placa de jugo de uva. Con levadura, mantenga la jaula de las patas a temperatura ambiente; las moscas pondrán huevos durante hasta 10 días, al menos un día antes del experimento. Prepare las agujas para inyección y manténgalas a cuatro grados Celsius.El día del experimento, prepare y cargue las agujas. Primero, retire la tubulina etiquetada del congelador y colóquela en hielo durante cinco a 15 minutos. A continuación, dilúyala con tampón GPEM y luego centrifúguela de 10 a 15 minutos a 13.000 RPM a cuatro grados Celsius.Finalmente, cargue de uno a dos microlitros en la aguja y manténgala a cuatro grados Celsius para prevenir la polimerización inducida por la temperatura en la aguja. Antes de colocar la cubreobjetivo, prepare pegamento de heptano enrollando cinta adhesiva doble y colocándola en un frasco de 100 mililitros.Agregue aproximadamente 50 mililitros de heptano, selle el frasco y agítelo durante varios días. Antes de preparar los embriones, prepare una cámara de deshidratación en la que se colocarán los embriones antes de la inyección. Para ello, coloque una parte de una placa de 35 milímetros dentro de una placa de Petri de 100 milímetros para hacer una mesa, agregue desecante, a la derecha, que sea sulfato de calcio anhidro alrededor, de modo que la altura del desecante a la derecha no sea mayor que la de la mesa, y cúbrala.Para comenzar la preparación de los embriones, primero recóctalos de la jaula lacustre cambiando la placa de jugo de uva con levadura cada hora; los embriones deben observarse aproximadamente dos horas después del inicio de la recolección. Para preparar la cubreobjetivo, colócala en un lado de un portaobjetivo y sujeta las cuatro esquinas con cinta para que no se mueva. Utilizando un aplicador de algodón, coloca una capa de cola de heptano en forma de línea sobre la cubreobjetivo.El pegamento no debe ser viscoso y debe secarse en unos pocos segundos. Si es demasiado espeso, agregue más heptano. Finalmente, coloque un trozo de cinta adhesiva doble cara en el portaobjetos junto a la cubreobjetos.Deslice con un pincel humedecido. Retire cuidadosamente los embriones de la placa de jugo de uva y colóquelos sobre la cinta adhesiva doble cara del portaobjetos. A continuación, utilice una de las puntas de una pinza para rodar los embriones sobre la cinta adhesiva doble cara hasta que el corion se abra.Recoger el embrión girándolo suavemente sobre el Corian para que se adhiera a la pinza y colocarlo sobre el pegamento de heptano en la cubierta. Colocar con el lado largo del embrión paralelo al lado largo de la cubierta. Colocar de 10 a 20 embriones en una fila.Retire el cubreobjetos y colóquelo en la cámara de deshidratación durante tres a ocho minutos. El tiempo depende de la humedad local y de la cantidad que se va a inyectar. A continuación, coloque el cubreobjetos sobre una cámara metálica con grasa al vacío.Finalmente, cubra los embriones con aceite de halo carbono para evitar una mayor deshidratación. Los embriones ya están listos para la inyección. Primero, localice los embriones bajo un objetivo de 16 x.Mueva los embriones hacia un lado y localice la aguja sin mover el plano focal. Centre la aguja y muévala hacia arriba sin desplazarla en la dirección X o Y. Para abrir la aguja, coloque el borde del cubreobjetos en el campo de visión, pero no en el lugar donde estará la aguja.Y baje la aguja hasta el mismo plano focal. Mueva con mucho cuidado la laminilla hasta que toque la aguja y la rompa suavemente. Suba la aguja.Ahora coloque los embriones a la vista. Introduzca la aguja en el aceite y asegúrese de obtener gotas de líquido bien definidas de la punta de la aguja. Mueva el embrión hacia la aguja de forma constante, inyecte una gota dentro del embrión y luego retire el embrión.Después de que se hayan inyectado todos los embriones, están listos para ser observados en un microscopio confocal con un objetivo de 60 o 100 x. Un embrión control debería verse como el que aparece en esta película. Este es un embrión que expresa tubulina GFP e histona RFP, capturado con un objetivo de 100 x en un microscopio confocal de disco giratorio.El tiempo total mostrado es de ocho minutos. Las gráficas de la distancia de polo a polo son muy reproducibles y constituyen una medida confiable del éxito en embriones control. Deberían verse como las mostradas aquí para los ciclos 11 a 13.En esta película se muestra otro embrión control. Este expresa KLP 61 FGFP y fue inyectado con tubulina r Domine. También fue observado con un objetivo de 100 x en un microscopio confocal de disco giratorio, y el tiempo total es de siete minutos.Esta película se obtuvo inmediatamente después de la microinyección, y el gradiente en la concentración de tubulina r Domine es claramente visible al inicio del video. Estos embriones pueden utilizarse para estudiar la inhibición de Klp 61 F tras la microinyección del anticuerpo contra Klp 61 F. Podemos observar la pérdida de Klp 61 FGFP de los husos.Acabamos de mostrarle cómo microinyectar embriones de Drosophila con incisión. Al realizar este procedimiento, es importante recordar realizar controles, primero practicar inyectando tampón o rutina solamente, y asegurarse de que la mitosis avance normalmente a través de la fase celular. Una vez que todas sus inyecciones sean confiables y no causen daño, puede inyectar un inhibidor y estudiar el efecto de esa inhibición particular.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar imágenes en vivo de la división asimétrica de las células madre de la línea germinal (GSC) en el nicho ovárico de Drosophila. Utilizamos una línea transgénica que expresa de forma ubicua una fusión de proteína verde fluorescente (GFP) de la proteína espectrosómica Par-1.

Imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de Drosophila melanogaster

Estos protocolos describen cómo caracterizar la organización y la función de oclusión de las uniones septadas plisadas en epitelios embrionarios de Drosophila de control y mutantes.

Experimentos de inmunotinción y penetración de colorantes para definir proteínas de unión septata plisadas en el núcleo en epitelios embrionarios de Drosophila

Aprende técnicas de microinyección para estudiar la mitosis en embriones sincitiales de Drosophila melanogaster. Este método permite visualizar procesos celulares con alta resolución y comprender la división celular.

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

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