Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

Este procedimiento comienza con la recolección de embriones en platos de jugo de uva fresco de 30 a 60 minutos. Después de quitar la placa de la jaula del lago, recoja los embriones con un cepillo humedecido y colóquelos en cinta adhesiva doble. Enrolle suavemente un embrión sobre la cinta con la mitad de una pinza hasta que el corion se abra.

Levanta el embrión y colócalo suavemente sobre la cubierta. Deslízalo sobre una capa de pegamento het. Repite esto hasta que tengas suficientes embriones.

Después de la deshidratación, los embriones están listos para la inyección. Hola, soy Ingrid Bruce Musher del laboratorio del Dr. Jonathan Sculley en el Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de California Davis. Hoy te mostraremos un procedimiento para microinyectar embriones sincitiales de Drosophilas.

Utilizamos este procedimiento para estudiar el papel de los micro ttes y los motores mitrales en la mitosis. Por ejemplo, microinyectamos anticuerpos u otros inhibidores de proteínas mitóticas específicas. Mediante el análisis del efecto del inhibidor sobre la mitosis, podemos determinar la función de las proteínas diana.

Así que comencemos. Para comenzar los preparativos dos o tres días antes del experimento, instale la jaula de colocación cortando dos pequeños agujeros de aproximadamente un centímetro cuadrado en lados opuestos de una botella de plástico. Rellena los agujeros con un trozo de algodón, permitiendo que fluya el aire.

Golpea las moscas en la botella y luego cúbrela con un plato de jugo de uva. Con levadura, mantenga la jaula de las patas a temperatura ambiente, las moscas pondrán huevos hasta 10 días al menos un día antes del experimento. Tire de las agujas para la inyección y manténgalas a cuatro grados centígrados.

El día del experimento, prepare y cargue las agujas. Primero, saque la tubulina etiquetada del congelador y póngala en hielo durante cinco a 15 minutos. A continuación, dilúyalo con tampón GPEM y luego centrifugue durante 10 a 15 minutos a 13, 000 RPM cuatro grados Celsius.

Finalmente, cargue uno o dos microlitros en la aguja y manténgala a cuatro grados centígrados. Para evitar la polimerización inducida por la temperatura en la aguja. Antes de colocar el cubreobjetos, haga pegamento de heptano enrollando cinta adhesiva doble y colocándola en una botella de 100 mililitros.

Agregue unos 50 mililitros de heptano, selle la botella y muévala durante varios días. Antes de preparar los embriones, haga una cámara de deshidratación en la que se colocarán los embriones antes de la inyección. Para hacer esto, coloque una parte de un plato de 35 milímetros dentro de una placa de Petri de 100 milímetros para hacer una mesa agregue secadora, a la derecha, que es sulfato de calcio anhidro a su alrededor para que la altura de la secadora a la derecha no sea más alta que la mesa y la tapa.

Para comenzar a preparar los embriones, primero, recójalos de la jaula del lago cambiando el plato de jugo de uva con levadura cada hora, los embriones deben ser fotografiados aproximadamente dos horas después del inicio de la recolección. Para preparar el cubreobjetos, colóquelo en un lado de un microscopio, deslice y pegue las cuatro esquinas con cinta adhesiva para que no se mueva. Con un aplicador con punta de algodón, coloque una capa de pegamento de heptano en una línea en el cubreobjetos.

El pegamento no debe ser viscoso y debe secarse en unos segundos. Si está demasiado espeso, agregue más heptano. Por último, pon un trozo de cinta adhesiva doble en el portaobjetos junto a la cubierta.

Deslízalo con un cepillo humedecido. Recoja con cuidado los embriones del plato de jugo de uva y colóquelos en la cinta adhesiva doble en el portaobjetos. A continuación, use la mitad de una pinza para enrollar los embriones sobre la cinta adhesiva doble hasta que el corion se abra.

Recoge el embrión haciéndolo rodar suavemente sobre el Corian para que se pegue a la pinza y colócalo sobre el pegamento de heptano de la cubierta. Desliza con el lado largo del embrión paralelo al lado largo de la funda. Coloque de 10 a 20 embriones en una fila.

Retire el cubreobjetos y colóquelo en la cámara de deshidratación durante tres a ocho minutos. El tiempo depende de la humedad local y de la cantidad a inyectar. A continuación, coloque el cubreobjetos en una cámara metálica con grasa al vacío.

Por último, cubre los embriones con aceite de carbono de halo para evitar una mayor deshidratación. Los embriones ya están listos para la inyección. Primero, encuentra los embriones bajo un objetivo de 16 x.

Aleja los embriones y encuentra la aguja sin mover el plano focal. Centre la aguja y muévala hacia arriba sin moverla en la dirección X o Y. Para abrir la aguja, coloque el borde del cubreobjetos en el campo de visión, pero no donde estará la aguja.

Y baja la aguja al mismo plano focal. Mueva con mucho cuidado el cubreobjetos hasta que golpee la aguja y la abra suavemente. Mueve la aguja hacia arriba.

Ahora trae los embriones a la vista. Baje la aguja en el aceite y asegúrese de obtener buenas gotas de líquido de la aguja. Mueva constantemente el embrión en la aguja, inyecte una gota en el embrión y luego aleje el embrión.

Una vez que se han inyectado todos los embriones, están listos para la observación en un microscopio confocal con un objetivo de 60 o 100 x. Un embrión de control debe parecerse al de esta película. Se trata de un embrión que expresa tubulina GFP e histona RFP visualizado con un objetivo de 100 x en un microscopio confocal de disco giratorio.

El tiempo total mostrado es de ocho minutos. Las parcelas de distancia entre polos son muy reproducibles y son una medida fiable del éxito en los embriones de control. Deben tener un aspecto similar al que se muestra aquí para los ciclos 11 a 13.

En esta película se muestra otro embrión de control. Este expresa KLP 61 FGFP e inyectado con t Domine tubulina. Esto también se fotografió con un objetivo de 100 x en un disco giratorio confocal, y el tiempo total es de siete minutos.

Esta película se adquirió inmediatamente después de la microinyección, y el gradiente en la concentración de r Domine tubulina es claramente visible al comienzo de la película. Estos embriones se pueden utilizar para estudiar la inhibición de Klp 61 F después de la microinyección del anticuerpo Klp 61 F. Podemos ver la pérdida de Klp 61 FGFP de los husillos.

Acabamos de mostrarte cómo microinyectar embriones incisionales de Drosophilas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar realizar controles, primero practicar la inyección de tampón o rutina sola, y asegurarse de que la mitosis proceda normalmente a través de la célula. Una vez que todas sus inyecciones sean confiables y no causen daño, puede inyectar un inhibidor y estudiar el efecto de esa inhibición en particular.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.