Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

El objetivo general de este procedimiento es registrar la activación del canal BK bajo voltaje controlado, al mismo tiempo que se controla la solución intracelular. Esto se logra primero expresando los canales BK en ovocitos de Xenopus mediante la inyección de ARNm del canal BK. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar el sistema de perfusión.

El tercer paso del procedimiento consiste en formar un sello gigaseal entre la membrana del ovocito y la pipeta de registro. El paso final del procedimiento es excindir el parche de membrana. En última instancia, los resultados obtenidos mediante el uso de la técnica de registro de parche acoplada a un sistema de perfusión muestran que los canales BK se activan por cambios en el voltaje y en la concentración de calcio.

Hola, soy Jin Cho Young del laboratorio del Dr. Jamie Zu en la Universidad de Washington. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, incluyendo preguntas sobre el mecanismo molecular de la activación de canales iónicos. Así que comencemos.

El primer paso del procedimiento comienza unos días antes del registro mediante parche y utiliza ARNm del canal BK transcrito in vitro. Después de obtener los ovocitos de Xenopus laevis en estadio cinco a seis, inyecte de 0,05 a 50 nanogramos de ARNm del canal BK en un ovocito. Utilice un nanoinyector automático de nanolitros para la inyección.

Repita la inyección en una docena de ovocitos para cada ARNm tras la inyección. Enjuague los ovocitos dos veces utilizando solución ND 96. Luego coloque los ovocitos en una placa de cultivo e incúbelos a 18 grados Celsius durante dos días o más para permitir que los ovocitos expresen el canal BK.

Tras dos a cinco días de incubación, los ovocitos deberían estar expresando canales BK y ya estar listos para el registro mediante parche. Antes de manipular los ovocitos, prepare todo lo demás que necesitará para el registro mediante parche, comenzando con el sistema de perfusión. El sistema que se muestra aquí es el enlace de válvula automatizado.

El sistema de perfusión 16 utiliza nitrógeno presurizado para impulsar las soluciones de perfusión fuera de los depósitos de solución, a través de los tubos de perfusión y hacia el lápiz y la punta de perfusión. El flujo de cada corriente de solución de perfusión está controlado por una válvula del depósito y una válvula electrónica. En este protocolo, uno de los depósitos no está presurizado y funciona como colector de residuos, así como mecanismo de liberación de presión.

Pueden prepararse previamente soluciones de perfusión con diferentes concentraciones de calcio o magnesio antes de los experimentos. Añada las soluciones de perfusión a los depósitos y etiquete cada uno para indicar la concentración de calcio o magnesio. Para montar primero el sistema de perfusión, conecte los tubos al lápiz de perfusión.

Luego encienda el controlador de válvulas electrónicas y abra las válvulas electrónicas para asegurarse de que los tubos y el lápiz de perfusión estén libres de obstrucciones y burbujas de aire. Pase agua desionizada a través de cada tubo utilizando una jeringa llena de agua desionizada. En este momento, conecte los tubos a los depósitos de solución y abra la válvula del cilindro de gas para aplicar presión con nitrógeno.

Abra una válvula del depósito para llenar el tubo con una de las soluciones del depósito. Si es necesario, haga clic en la válvula del depósito para eliminar las burbujas en la solución. Cierre la válvula del depósito después de que el tubo esté lleno con la solución, llene la punta de perfusión con agua y enrósquela en el lápiz de perfusión.

Tenga cuidado de no atrapar burbujas. Al conectar la punta, fije el lápiz de perfusión al soporte del baño utilizando arcilla modelable y asegúrese de que la punta de perfusión esté dentro del espacio del baño. El sistema de perfusión ya está configurado.

En este momento, agregue agua desionizada al baño. Asegúrese de que la punta de perfusión esté sumergida en el agua. Compruebe que cada solución de perfusión salga correctamente por la punta de perfusión.

Cierre la válvula electrónica conectada al tubo del colector de desechos y abra la válvula de una de las soluciones de perfusión. Observe bajo el microscopio el chorro de líquido de perfusión que sale de la punta de perfusión. Cierre la válvula de esa solución de perfusión y abra la válvula del colector de desechos.

El chorro de perfusión debería desaparecer casi por completo. Repita la misma prueba para cada una de las soluciones de perfusión. Una vez que haya verificado que todas las soluciones de perfusión fluyen correctamente, sustituya el agua desionizada del baño por la solución de baño deseada.

Ahora es el momento de preparar el aparato de grabación. Debe recubrir nuevamente el electrodo de grabación de plata con cloruro de plata antes de cada sesión de registro por parche. Primero, retire el alambre del electrodo del porta-pipeta y sumerja la mitad del extremo del alambre del electrodo en un vial que contenga lejía fresca durante al menos 15 minutos.

Esto deposita una capa de cloruro de plata sobre el alambre. Enjuague el alambre del electrodo con agua desionizada y séquelo con papel absorbente. Luego, instale nuevamente el electrodo de plata-cloruro de plata en el portapipetas.

Ahora encienda su computadora. Conecte la llave de hardware al puerto de la impresora de su computadora. La llave de hardware debe estar conectada para poder utilizar el software de adquisición de datos, que es HEA pulse.

Encienda el amplificador e inicie el software de adquisición de datos. Pulso HEA. Cargue el archivo del protocolo y ajuste la configuración, como la escala del estímulo.

El objetivo de ajustar la configuración de los parámetros es asegurar que el potencial de prueba sea exactamente igual al potencial de comando. Ahora estamos listos para preparar los ovocitos. Recupere los ovocitos del incubador.

Sumerja el ovocito en la solución de desprendimiento durante cinco a diez minutos. La solución de desprendimiento separa la membrana vitelina de la membrana plasmática, lo que permite retirar la membrana vitelina. Después de cinco a diez minutos, retire suavemente la membrana vitelina del ovocito.

Utilizando dos pinzas. Un sitio divi OC es extremadamente frágil y, por lo tanto, debe moverse lo menos posible. Teniendo cuidado de evitar exponer el ovocito Devi al aire o a burbujas, use una pipeta de vidrio llena con suficiente solución para transferir el ovocito al baño.

Los canales en la membrana del ovocito ya están expuestos y listos para la pipeta de registro. Prepare una pipeta de registro insertando un tubo capilar de vidrio en el tirador de micropipetas. Observe las pipetas bajo un microscopio para determinar la forma de la punta y el diámetro de la abertura.

El diámetro de la abertura debe ser de dos a cuatro micrómetros para reducir la corriente capacitiva durante la grabación, y para asegurar una punta suave, recubra la punta con cera y luego caliéntela. Pólmala bajo un microscopio. Llene la punta de la pipeta colocando la punta dentro de la solución para pipeta y tirando del émbolo.

Esto humedece la punta de la pipeta. A continuación, llene la pipeta hasta un tercio de su capacidad con la solución para pipeta utilizando una jeringa. Luego coloque la pipeta en el porta-pipetas con el electrodo de plata y cloruro de plata en su interior.

Asegúrese de que el electrodo de alambre esté en contacto con la solución de la pipeta. El siguiente paso es excindir un parche de dentro hacia afuera del ovocito preparado. Primero, localice el borde claro del ovocito bajo el microscopio.

Utilizando el manipulador, mueva la pipeta de registro cerca del ovocito, asegurándose de que quede sumergida. En la solución del baño, registre la resistencia en serie de la pipeta. La resistencia en serie ideal de la pipeta de registro está entre uno y 1,5 miliohmios cuando está llena con la solución de la pipeta y sumergida en la solución del baño.

Ahora, empuje lentamente la pipeta contra el ovocito hasta que su resistencia aumente aproximadamente al doble. Obtenga un sello en el rango de gigaohmios aplicando una succión suave mediante la boca a través de un tubo de succión conectado al porta-pipetas. Después de confirmar que se ha formado un sello en el rango de gigaohmios, estabilice el parche manteniéndolo a menos 30 milivoltios durante unos minutos.

Para obtener un parche interior exterior, excise el parche empujando rápidamente la pipeta más hacia el interior del sitio OO y luego retirándola suavemente. El parche interior exterior ya está listo para el registro mediante parche. Mueva la pipeta que sostiene el parche interior exterior a unos 100 micrones de distancia de la abertura de la punta de perfusión.

Cierre la válvula electrónica para la recolección de desechos y abra la válvula del depósito para la solución de perfusión deseada. Comience a registrar las corrientes a través del parche. Cambie el voltaje y las soluciones de perfusión según sea necesario.

Cuando haya terminado de grabar, limpie los tubos de perfusión, el lápiz y la punta pasando agua desionizada para evitar obstrucciones. Las grabaciones de parche de bloqueo obtenidas aquí muestran que los canales BK de tipo silvestre en un parche de membrana de ovocito responden tanto al voltaje como al calcio. Esta figura muestra una grabación de parche con calcio nominalmente cero en la solución de perfusión.

Las ondas cuadradas sobre los trazos de corriente indican el voltaje aplicado al parche. Se aplicaron cuatro voltajes que variaron desde 50 milivoltios hasta 200 milivoltios en incrementos de 50 milivoltios. La corriente máxima, aproximadamente dos nanoamperios, se obtuvo con el voltaje máximo de 200 milivoltios.

Este aumento en la amplitud de la corriente con el incremento del voltaje indicó que la probabilidad de apertura de los canales BK aumentó con el voltaje. Esta figura muestra la respuesta del parche de interior hacia afuera a diferentes voltajes. Cuando había un micromolar de calcio en la solución de perfusión, se aplicaron escalones de voltaje.

Como en la figura anterior, la respuesta al escalón de voltaje de 200 milivoltios, la respuesta superior aumentó a aproximadamente tres nanoamperios cuando había calcio en el Perfusado en comparación con dos nanoamperios sin calcio. Esto indica que la probabilidad de apertura de los canales BK aumentó en presencia de calcio. En resumen, este procedimiento de registro en parche demostró que los canales BK dependen del voltaje y del calcio.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar la activación del canal de hierro utilizando la técnica de registro de parche acoplada a un sistema de perfusión. Ahora. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.