Name: Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados en Xenopus Ovocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprende a registrar la activación de canales BK mediante técnicas de patch clamp en ovocitos de Xenopus. Este método permite controlar la solución intracelular y estudiar la función de canales iónicos.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01-R01-HL70393 y NS060706 a JCJC es un profesor de ingeniería biomédica de la Fundación Spencer T. Olin.

1. La inyección de ARNm en los oocitos <ol><li> Inyectar 0,05 a 50 ng de ARN mensajero que se transcribe in vitro en ovocitos de Xenopus laevis (fase V-VI) con Nanoject II Auto-Inyector nanolitros (Drummond Scientific Company, modelo 3-000-204). Repetir la inyección en una docena de ovocitos de cada ARNm. </li><li> Enjuague los ovocitos inyectados dos veces con solución de ND-96 (96 mM de cloruro de sodio (NaCl, el Sr. 58,44 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl, el Sr. 74,56 g / mol), 1,8 mM de cloruro de calcio (CaCl 2 • 2H 2 O , el Sr. 147.02), 1 mM de cloruro de magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, el Sr. 203,31 g / mol), 5 mm 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, el Sr. 238,31 g / mol), 2,5 mM piruvato de sodio (Sr. 110,04 g / mol), y 1 de penicilina-estreptomicina. pH 7,6), y luego colocarlos en una placa de cultivo y se incuba a 18 ° C durante 2 días +. </li></ol> 2. Preparación del sistema de perfusión <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Ilustración del sistema de Automatización de ValveLink perfusión 16. El sistema de perfusión utiliza nitrógeno a presión para empujar las soluciones de perfusión de los embalses de solución, a través de los tubos de perfusión, y el lápiz de perfusión y la propina. El flujo de cada flujo de solución de perfusión es controlada por la válvula de un depósito y una válvula electrónica. En este protocolo, uno de los reservorios no está presurizado, y funciona como un recolector de residuos, así como un mecanismo de liberación de presión. (Imagen adaptada de http://www.autom8.com sitio web del proveedor) <ol><li> Conectar los tubos para el lápiz de perfusión. Encienda el controlador de la válvula electrónica y abrir las válvulas electrónicas. </li><li> Para asegurar que los tubos y el lápiz de la perfusión es libre de burbujas y tapar el aire, empuje desionizada (DI) a través de cada tubo con una jeringa llena de agua desionizada. </li><li> Conectar los tubos a los depósitos de solución y abrir la válvula del cilindro de gas a aplicar nitrógeno a presión. </li><li> Abra la válvula del depósito para llenar la tubería con una solución de reserva. Flick de la válvula de reservorio para eliminar las burbujas en la solución si es necesario. Cierre la válvula después de que el tubo se llena con la solución. </li><li> Llenar la punta de perfusión con agua y apriete los tornillos en el lápiz de la perfusión. Tenga cuidado de no atrapar las burbujas cuando se conecta la punta. </li><li> Fijar el lápiz de perfusión a la etapa de baño usando arcilla. Asegúrese de que la punta de la perfusión en el espacio de baño. El sistema de perfusión ya está configurado. </li><li> Añadir agua desionizada en el baño. Asegúrese de que la punta de la perfusión se sumerge en el agua. </li><li> Prueba de que cada solución de perfusión que sale de la punta de la perfusión correctamente. Cierre la válvula electrónica conectada a la tubería del colector de residuos y abrir la válvula para la solución de perfusión de uno en uno (140 mM de hidróxido de potasio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM de 4 - (2-hidroxietil) -1 - piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM de etilenglicol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetraacético (EGTA, M r 380,35 g / mol), se ajusta el pH a 7,1-7,2 por ácido metanosulfónico (MESO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + o Mg2 + se suma a la concentración deseada cuando sea necesario). Bajo el microscopio, observar el chorro de líquido de perfusión que sale de la punta de la perfusión. Cierre la válvula de solución de perfusión y abrir la válvula para el recolector. El chorro de la perfusión debe casi desaparecer. Repita la misma prueba para todas las soluciones para infusión. </li><li> Cuando haya verificado que todas las soluciones de flujo de perfusión correctamente, reemplace el agua DI en el baño con una solución de baño (140 mM de hidróxido de potasio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl, M r 74,56 g / mol), se ajusta el pH a 7,1-7,2 por ácido metanosulfónico (MESO 3, M r 96,1 g / mol)). </li></ol> 3. Patch clamp <ol><li> Recubrir el electrodo de registro Ag con AgCl antes de cada sesión de patch clamp. En primer lugar, quitar el cable del electrodo del titular de la pipeta y sumergir la media punta de la aguja electrodo en un frasco que contiene lejía fresca durante al menos 15 minutos. Esto deposita una capa de AgCl en el cable. </li><li> Enjuague el alambre del electrodo con agua destilada y secar. Luego de instalar el electrodo de Ag / AgCl de nuevo en el soporte de la pipeta. </li><li> Conecte el baño (de referencia) del electrodo a la headstage y colocarlo en el baño. Esto prepara a los electrodos para la grabación. </li><li> Ahora a prepararse para la adquisición de datos. Encienda el ordenador y conectar la llave de hardware en el puerto de impresora de su ordenador. La llave de hardware debe estar conectado para poder utilizar el software de adquisición de datos, que es HEKA pulso. </li><li> Encienda el amplificador (Axon Instruments, artefactos explosivos abandonadosPARCHE 200B) y empezar a HEKA pulso. Cargar el archivo de protocolo y los ajustes de configuración, como la Escala de estímulo. El objetivo para el ajuste de los parámetros de configuración es asegurar que el potencial de la prueba es exactamente igual a la capacidad de mando. Esto prepara el equipo de adquisición de datos. </li><li> Prepare los ovocitos. Sumerja el ovocito en la solución de extracción (200 mM de N-metil-D-glucamina (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM aspartato (no K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM de etilenglicol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM de cloruro de magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), se ajusta el pH a 7,4 con hidróxido de sodio (NaOH, M r 40,0 g / mol) de 5 - 10 min. La solución de extracción se separa la membrana vitelina de la membrana plasmática que permite despojar a la membrana vitelina. </li><li> Suavemente tira de la membrana vitelina del ovocito utilizando dos pares de pinzas. Un ovocito devitellinized es extremadamente frágil y, por tanto, moverse tan poco como sea necesario. </li><li> Teniendo cuidado de evitar la exposición de los ovocitos devitellinized de aire o burbujas, utilizar una pipeta de vidrio llena con una solución suficiente para transferir el óvulo de la bañera. Esto prepara al ovocito para la grabación. </li><li> Prepare pipetas parche. Tire de la pipetas de vidrio después de la inserción de un tubo capilar de vidrio (VWR International, Cat # 53432 a 921) en un Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipeta extractor. Observe las pipetas bajo el microscopio para determinar la forma de la punta y el diámetro de apertura. El diámetro de la abertura debe ser 4.2 micrómetros. </li><li> Para reducir la corriente capacitiva durante la grabación y para asegurar una punta suave, cubra la punta con cera y luego el fuego de uñas. </li><li> Llenar la pipeta mediante la colocación de la punta de la pipeta dentro de la solución de la pipeta (140 mM de hidróxido de potasio (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM de cloruro de potasio (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM de cloruro de magnesio (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), se ajusta el pH a 7,1-7,2 por metano ácido (MESO 3, M r 96,1 g / mol)) y el dibujo del émbolo. Este moja la punta. </li><li> Llenar la pipeta 1 / 3 del total con una solución de pipeta con una jeringa y coloque la pipeta en el soporte de la pipeta con el interior del electrodo Ag / AgCl y el contacto con la solución de la pipeta. Esto prepara el parche pipeta. </li><li> Para extirpar un parche de dentro a fuera de los ovocitos preparados, encuentre la clara ventaja de los ovocitos bajo el microscopio. Mueva el parche pipeta cerca del ovocito utilizando manipulador. Registrar la resistencia de serie de la pipeta. La resistencia en serie ideal de la pipeta parche está entre 1-1.5 mW cuando se llena con solución de la pipeta y se sumergen en una solución de baño. </li><li> Vuelva a introducir con la pipeta contra el ovocito hasta que la resistencia se duplica. </li><li> Aplicar succión suave a la membrana por vía oral a través de un tubo de aspiración que está conectado al titular de la pipeta hasta que un sello de giga-ohm se obtiene. Estabilizar el parche mediante la celebración de la tensión en mV -30 para un par de minutos. </li><li> Para obtener un parche de adentro hacia fuera, los impuestos especiales por el parche rápidamente empujando aún más la pipeta en el ovocito y luego tirando de él hacia fuera. </li><li> El parche de adentro hacia afuera ya está listo para la sujeción. Mueva la pipeta de sujeción del parche de adentro hacia fuera a cerca de 100 micras de distancia de la abertura de la punta de la perfusión. </li><li> Cierre la válvula electrónica de recogida de residuos y abra la válvula de reservorio para la solución de perfusión deseado </li><li> Comenzar a grabar las corrientes a través del parche. Cambiar las soluciones de tensión y de la perfusión como se desee. </li><li> Cuando haya terminado de grabar, limpie la perfusión de tubos, lápiz y punta empujando a través de agua destilada para evitar obstrucciones. </li></ol> 4. Resultados representante Durante la preparación de los oocitos de patch clamp, el tratamiento de 5-10 minutos de la solución de extracción se separan de la membrana vitelina de la membrana plasmática, lo que hace posible extracción de la membrana vitelina. La resistencia en serie ideal de la pipeta parche está entre 1-1.5 mW cuando se llena con solución de la pipeta y se sumergen en una solución de baño. A continuación se presenta un registro representativo de tipo salvaje canales BK en un parche de membrana del ovocito. En la parte superior izquierda, las ondas cuadradas indican el voltaje aplicado a la mancha - el segundo paso de los aumentos de voltaje de 50 mV a 200 mV con un incremento de 50 mV. A continuación se muestra las huellas correspondientes actual cuando la solución de perfusión ha nominal 0 Ca 2 + (libre [Ca 2 +] es de aproximadamente 0,5 nM). Enaumento de la amplitud de la corriente indica que la probabilidad de abrir los canales BK de los incrementos de voltaje. En el lado derecho, el mismo parche es perfundidos con 1,0 M de Ca 2 + cuando se aplica con el protocolo mismo voltaje. La amplitud de la corriente se incrementa más en el mismo voltaje, lo que indica que la probabilidad aumenta con la abierta [Ca 2 +]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
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<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

El sistema de expresión de ovocitos es ideal para la caracterización electrofisiológica de los canales iónicos dependientes de voltaje debido a la relativamente baja de fondo de los canales endógenos. Además, dado que se trata de un sistema de expresión transitoria, que proporciona un método eficiente de llevar a cabo el estudio de mutagénesis de estos canales. Sin embargo, cabe señalar que el sistema de expresión de los ovocitos es diferente de la de células de mamíferos, por lo tanto puede haber diferencias en la modi...

<table><tbody><tr><td>Inyector automático de nanolitros Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas Flaming/Brown P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión y controlador electrónico</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>Diámetro interno de la punta de perfusión: 100 micrones</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>Interfaz de computadora</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal amplificador (Headstage)</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en xenopus ovocitos

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

El protocolo que aquí se presenta está diseñado para estudiar la activación de la gran conductancia, el voltaje y Ca 2 +-K + activado (BK) canales. El protocolo también puede ser usado para estudiar la relación estructura-función de otros canales iónicos y receptores de los neurotransmisores 1. Canales BK se expresan ampliamente en diferentes tejidos y se han implicado en muchas funciones fisiológicas, incluyendo la regulación de la contracción del músculo liso, Ajuste de la frecuencia de las células ciliadas internas y la regulación de la liberación de neurotransmisores 2-6. Canales BK son activados por despolarización de la membrana y por intracelular de Ca 2 + y Mg 2 + 9.6. Por lo tanto, el protocolo está diseñado para controlar tanto el voltaje de la membrana y la solución intracelular. En este protocolo, el ARN mensajero de los canales BK se inyecta en ovocitos de Xenopus laevis (fase V-VI), seguido de 2-5 días de incubación a 18 ° C 10-13. Parches de membrana que contienen canales BK uno o varios son extirpados con la configuración de adentro hacia afuera utilizando técnicas de patch clamp 10-13. La parte intracelular del parche es perfundidos con soluciones deseadas durante la grabación para que la activación del canal en condiciones diferentes pueden ser examinados. En resumen, el ARNm de los canales BK se inyecta en ovocitos de Xenopus laevis que expresan proteínas de canales en la membrana del ovocito, las técnicas de patch clamp se utilizan para registrar las corrientes que fluyen a través de los canales de bajo voltaje controlado y soluciones intracelulares.

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan en<em&gt; Oocitos de Xenopus</em&gt; Mediante la inyección de ARN mensajero. La solución intracelular durante las grabaciones de patch clamp es controlado por un sistema de perfusión.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

El protocolo aquí presentado está diseñado para estudiar la activación de los canales de K+ activados por voltaje y Ca2+ de gran conductancia (BK). El protocolo puede...

El objetivo general de este procedimiento es registrar la activación del canal BK bajo voltaje controlado, al mismo tiempo que se controla la solución intracelular. Esto se logra primero expresando los canales BK en ovocitos de Xenopus mediante la inyección de ARNm del canal BK. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar el sistema de perfusión.El tercer paso del procedimiento consiste en formar un sello gigaseal entre la membrana del ovocito y la pipeta de registro. El paso final del procedimiento es excindir el parche de membrana. En última instancia, los resultados obtenidos mediante el uso de la técnica de registro de parche acoplada a un sistema de perfusión muestran que los canales BK se activan por cambios en el voltaje y en la concentración de calcio.Hola, soy Jin Cho Young del laboratorio del Dr. Jamie Zu en la Universidad de Washington. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, incluyendo preguntas sobre el mecanismo molecular de la activación de canales iónicos. Así que comencemos.El primer paso del procedimiento comienza unos días antes del registro mediante parche y utiliza ARNm del canal BK transcrito in vitro. De

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Describimos un método para cuantificar la actividad de las ATPasas de tipo P que contratransportan K+ mediante la expresión heteróloga de las enzimas en los ovocitos de Xenopus y midiendo la absorción de Rb+ o Li+ en células individuales mediante espectrofotometría de absorción atómica. El método es una alternativa sensible y segura a los experimentos de flujo de radioisótopos, ya que facilita estudios cinéticos complejos.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Para complementar los métodos comúnmente utilizados para el estudio de TRPV4, dos métodos se describen: Su mechanosensitivity puede ser estudiado por Ca 2 +-luminometría aecuorina en la levadura transgénica a partir del desafío hipo-osmótica. También puede ser examinado en TRPV4-ARN inyectado ovocitos de Xenopus por células enteras de fijación de voltaje de dos electrodos o parche abrazadera en en-célula o el modo extirpado.

Luminométricos levadura y Xenopus ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

El enfoque de BPA vaselina de corte abierto se utiliza para obtener bajos grabaciones de ruido de corrientes iónicas y conmutación de canales iónicos dependientes de voltaje expresados ​​en oocitos de Xenopus con alta resolución de la cinética de canal rápido. Con modificaciones menores, fluorometría de fijación de voltaje puede estar acoplado con el protocolo de ovocitos de corte abierto.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

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Se describen procedimientos optimizados para el aislamiento de folículos individuales, microinyecciones de ARN citoplasmático, la eliminación de capas celulares circundantes y la expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Además, se presenta un método simple para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos con canales iónicos activados por ligandos.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Esta es una guía para modificar la forma de pipetas de vidrio. En concreto, mediante el uso de calor y presión de aire el cono se ensancha sin aumentar la apertura de la punta, lo que lleva a la resistencia a la pipeta inferior. Esto es fundamental para conseguir grabaciones de bajo nivel de ruido de células pequeñas, pero es útil en muchas aplicaciones.

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