Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

El objetivo general de este procedimiento es registrar la activación del canal BK bajo voltaje controlado, al mismo tiempo que se controla la solución intracelular. Esto se logra expresando primero los canales BK en los citos de Xenopus inyectándoles ARNm del canal BK. El segundo paso del procedimiento es preparar el sistema de perfusión.

El tercer paso del procedimiento es formar un giga sello entre la membrana del ovocito y la pipeta de parche. El paso final del procedimiento es extirpar el parche de membrana. En última instancia, los resultados obtenidos mediante el uso de la tecnología de pinza de parche junto con un sistema de profusión muestran que los canales BK se activan por cambios en el voltaje y la concentración de calcio.

Hola, soy Jin Cho Young del laboratorio del Dr. Jamie Zus en la Universidad de Washington. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, incluidas las preguntas relacionadas con el mecanismo molecular para la activación de los canales iónicos. Así que comencemos.

El primer paso del procedimiento comienza un par de días antes de la pinzación del parche y utiliza el ARNm del canal BK que se transcribió in vitro. Después de recolectar los citos de Xenopus Lavu en la etapa cinco a seis, inyecte de 0,05 a 50 nanogramos de ARNm del canal BK en un cito. Usando un inyector de nano inyector de dos nanolitros automáticos.

Repita la inyección en una docena de ovocitos por cada ARNm después de la inyección. Enjuague los ovocitos dos veces con la solución ND 96. A continuación, coloque los ovocitos en una placa de cultivo e incubelos a 18 grados centígrados durante dos o más días para dar tiempo a que los ovocitos expresen el canal BK.

Después de dos a cinco días de incubación, los ovocitos deben estar expresando canales BK y, por lo tanto, ya están listos para el pinzamiento del parche. Antes de manipular los ovocitos, prepare todo lo demás que necesitará para el pinzamiento del parche, comenzando con el sistema de perfusión. El sistema que se muestra aquí es el enlace de válvula automatizado.

El nitrógeno presurizado del sistema de profusión 16 empuja las soluciones de profusión fuera de los depósitos de solución a través de los tubos de profusión y hacia el lápiz y la punta de profusión. El caudal de cada corriente de solución de profusión está controlado por una válvula de depósito y una válvula electrónica. En este protocolo, uno de los depósitos no está presurizado y funciona como un colector de residuos, así como un mecanismo de liberación de presión.

de los experimentos se pueden preparar soluciones de perfusión de diferentes concentraciones de calcio o magnesio. Agregue las soluciones de perfusión a los depósitos y etiquete cada uno para indicar la concentración de calcio o magnesio. Para configurar primero el sistema de profusión, conecte los tubos al lápiz de profusión.

A continuación, encienda el controlador electrónico de válvulas y abra las válvulas electrónicas para asegurarse de que los tubos y el lápiz de profusión estén libres de obstrucciones y burbujas de aire. Empuje el agua desionizada a través de cada tubo con una jeringa llena de agua desionizada. En este punto, conecte los tubos a los depósitos de solución y abra la válvula del cilindro de gas para aplicar presurizado a nitrógeno.

Abra una válvula de depósito para llenar la tubería con una de las soluciones de depósito. Si es necesario, haga clic en la válvula del depósito para eliminar las burbujas de la solución. Cierre la válvula del depósito después de que el tubo esté lleno de solución, llene la punta de perfusión con agua y enrósquela en el lápiz de perfusión.

Tenga cuidado de no atrapar burbujas. Al conectar la punta, fije el lápiz de perfusión a la etapa de baño con arcilla para modelar, asegúrese de que la punta de profusión esté en el espacio de la bañera. El sistema de profusión ya está configurado.

En este punto, agregue agua desionizada al baño. Asegúrese de que la punta de profusión esté sumergida en el agua. Pruebe que cada solución de perfusión salga correctamente de la punta de perfusión.

Cierre la válvula electrónica conectada a la tubería del colector de residuos y abra la válvula para una de las soluciones de profusión. Bajo el microscopio, observe el chorro de líquido de profusión que sale de la punta de perfusión. Cierre la válvula de esa solución de profusión y abra la válvula del colector de desechos.

El chorro de profusión debería casi desaparecer. Repita la misma prueba para cada una de las soluciones de perfusión. Cuando haya verificado que todas las soluciones de perfusión fluyen correctamente, reemplace el agua desionizada en el baño con la solución de baño deseada.

Ahora es el momento de configurar el aparato de grabación. Debe volver a recubrir el electrodo de registro de plata con cloruro de plata antes de cada sesión de sujeción del parche. En primer lugar, retire el alambre del electrodo del soporte de la pipeta y sumerja la mitad de la punta del alambre del electrodo en un vial que contenga lejía fresca durante al menos 15 minutos.

Esto deposita una capa de cloruro de plata en el alambre. Enjuague el alambre del electrodo con agua desionizada y séquelo. A continuación, vuelva a instalar el electrodo de cloruro de plata en el soporte de la pipeta.

Ahora encienda su computadora. Conecte la llave de hardware en el puerto de la impresora de su computadora. La llave de hardware debe estar conectada para que pueda utilizar el software de adquisición de datos, que es HEA pulse.

Encienda el amplificador e inicie el software de adquisición de datos. Pulso HEA. Cargue el archivo de protocolo y ajuste los ajustes de configuración, como la escala de estímulo.

El objetivo de ajustar los ajustes de configuración es asegurar que el potencial de prueba sea exactamente igual al potencial del comando. Ahora estamos listos para preparar los ovocitos. Recupera los ovocitos de la incubadora.

Sumerja el ovocito en una solución de extracción durante cinco a 10 minutos. La solución de extracción separa la membrana de viel de la membrana plasmática, lo que permite separar la membrana de vitel. Después de cinco a 10 minutos, retire suavemente la membrana vitel del ovocito.

Usando dos pinzas. Un sitio divi OC es extremadamente frágil y, por lo tanto, debe moverse lo menos posible. Teniendo cuidado de evitar exponer el ovocito de Devi al aire o a las burbujas, utilice una pipeta de vidrio llena de suficiente solución para transferir el ovocito al baño.

Los canales de la membrana del ovocito están ahora expuestos y listos para la pipeta de parche. Tire de una pipeta de parche insertando un tubo capilar de vidrio en el extractor de micropipetas. Observe las pipetas bajo un microscopio para determinar la forma de la punta y el diámetro de la abertura.

El diámetro de la abertura debe ser de dos a cuatro micrómetros para reducir la corriente capacitiva durante la grabación y para garantizar una punta lisa, cubra la punta con cera y luego cocine. Púlelo bajo un microscopio. Llene la punta de la pipeta colocando la punta de la pipeta dentro de la solución de pipeta y extrayendo el émbolo.

Esto humedece la punta de la pipeta. A continuación, llene la pipeta hasta un tercio de su capacidad con solución de pipeta con una jeringa. A continuación, coloque la pipeta en el soporte de pipetas con el electrodo de plata, cloruro de plata en su interior.

Asegúrese de que el electrodo de alambre esté en contacto con la solución de pipeta. El siguiente paso es extirpar un parche del ovocito preparado. Primero, encuentra el borde transparente del ovocito bajo el microscopio.

Con el manipulador, acerque la pipeta de parche al ovocito, asegurándose de que esté sumergido. En la solución de baño, registre la resistencia en serie de la pipeta. La resistencia en serie ideal de la pipeta de parche es de entre uno y 1,5 miliohmios cuando se llena con solución de pipeta y se sumerge en una solución de baño.

Ahora empuje lentamente la pipeta contra el ovocito hasta que su resistencia se duplique aproximadamente. Obtenga un sellado de giga ohmios aplicando una succión suave por vía oral a través de un tubo de succión conectado al soporte de pipeta. Después de confirmar que se formó un sello giga, estabilice el parche sosteniéndolo a menos 30 milivoltios durante un par de minutos.

Para obtener un parche de adentro hacia afuera, extirpe el parche empujando rápidamente la pipeta más adentro del sitio OO y luego tirando suavemente de ella. El parche de adentro hacia afuera ahora está listo para la sujeción del parche. Mueva la pipeta que sujeta el parche del revés a una distancia aproximada de 100 micras de la abertura de la punta de perfusión.

Cierre la válvula electrónica para la recolección de residuos y abra la válvula del depósito para obtener la solución de profusión deseada. Comience a registrar las corrientes a través del parche. Cambie las soluciones de voltaje y profusión según lo desee.

Cuando termine de grabar, limpie el lápiz y la punta de los tubos de profusión empujando a través de agua desionizada para evitar obstrucciones. Los registros de pinza del parche obtenidos aquí muestran que los canales BK de tipo salvaje en un parche de membrana de ovocitos responden tanto al voltaje como al calcio. Esta figura muestra un registro de parche con calcio nominal cero en la solución de perfusión.

Las ondas cuadradas sobre las trazas de corriente indican el voltaje aplicado al parche. Se aplicaron cuatro voltajes que van desde 50 milivoltios hasta 200 milivoltios en incrementos de 50 milivoltios. La corriente máxima, aproximadamente dos nano amperios, se obtuvo con el voltaje máximo de 200 milivoltios.

Este aumento en la amplitud de la corriente con el aumento del voltaje indicó que la probabilidad de apertura de canales BK aumentaba con el voltaje. Esta figura muestra la respuesta del parche de adentro hacia afuera a diferentes voltajes. Cuando había un micromolar de calcio en la solución de perfusión, se aplicaron pasos de voltaje.

Al igual que en la figura siguiente, la respuesta al paso de voltaje de 200 milivoltios, la respuesta máxima aumentó a aproximadamente tres nanoamperios cuando había calcio en los ocho de Perfu en comparación con dos nanoamperios sin calcio. Esto indica que la probabilidad de apertura de los canales BK aumentó en presencia de calcio. En resumen, este procedimiento de sujeción del parche mostró que los canales BK dependían del voltaje y el calcio.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo grabar la activación del Canal de Hierro utilizando la técnica de abrazadera de parche junto con un sistema de abastecimiento de combustible profesional. Ahora. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.