El análisis de las células madre pluripotentes utilizando criosecciones de cuerpos embrioides
8 de diciembre de 2010
Las células madre pluripotenciales de crecimiento en suspensión se diferencian en cuerpos embrioides (EBS). Aquí se demuestra cómo obtener alta calidad cryosections EB útil para el estudio de los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, mientras que la preservación de su organización en forma de agregados.
Primera parte, Introducción. Hola, mi nombre es Rafael. Soy postdoc en el Laboratorio del Profesor Stevens Hans de la Universidad Federal de Río de Janeiro en Brasil.
Hola, mi nombre es Ismail. Soy asistente de investigación, también profesor. En este video, mostraremos cómo preparar secciones claras de cuerpos de Android.
Así que comencemos. Segunda parte, materiales y equipos. Para este procedimiento, necesitaremos un medio de inclusión para muestras congeladas.
4%Solución de aldehído Paraform para la fijación de las células, soluciones de sacarosa para crioprotección. Una aguja con la punta ligeramente doblada, un microscopio estereoscópico para una mejor visualización del EBS y un agitador. Tercera parte.
Aquí, los cuerpos de los embriones humanos se cultivan en placas de cultivo no adherentes. Con una pipeta, agrupamos todos los cuerpos embrionarios lo más cerca posible para transferirlos a un tubo cónico de 15 mililitros. Los EBS se cosechan cuidadosamente y se transfieren al tubo.
Es importante recolectar todos los ebs ya que no hay una gran cantidad de material. Después de decantar los EBS, los medios de cultivo se desechan cuidadosamente. Debería poder ver el pellet en la parte inferior del tubo. Ahora podemos proceder al procedimiento de fijación.
El EBS se fijará en una solución de aldehído Paraform al 4% en PBS o solución salina tamponada con fosfato. Es importante volver a suspender el pellet con una solución de PFA. A continuación, los EBS se fijan en una solución de fijación durante 30 minutos.
Después de la fijación, la solución de PFA se retira cuidadosamente. Teniendo cuidado de evitar que Resus suspenda el EBS y se reemplace con una solución de sacarosa al 10% en PBS para iniciar la protección criogénica del ebs, el material se mantiene durante 30 minutos en esta solución. A continuación, retiramos con cuidado la solución de sacarosa al 10% y volvemos a suspender el EBS en una solución de sacarosa al 20%.
Una vez más, los EBS se mantienen durante 30 minutos en esta solución. Finalmente, se retira la solución de sacarosa al 20% y se reemplaza por una solución de sacarosa al 30% en PBS donde se mantiene durante 30 minutos más. Ahora podemos proceder a la orientación y bloqueo de ebs.
En nuestro laboratorio, utilizamos cápsulas vacías como moldes. Para el bloqueo de ebs, es importante cubrir las paredes internas de la punta con solución de sacarosa antes de recolectar los ebs. Ahora podemos recoger con cuidado los EBS y esperar hasta que decanten hasta el fondo de la punta.
A continuación, los EBS se colocan en el centro del bloque. Esta debería ser la posición final de EBS dentro del bloque. Con la ayuda de un microscopio estereoscópico y una punta fina, recolectamos y descargamos la mayor cantidad posible de solución de sacarosa.
Siempre teniendo cuidado de no recoger los ebs. Usando una aguja con una punta ligeramente doblada, todos los EBS se colocan en el centro del bloque. Finalmente, la solución de sacarosa restante se recoge con trozos de papel de filtro.
La ubicación específica de EBS dentro del bloque es muy importante para obtener rebanadas de buena calidad. Este es un ejemplo de un mal posicionamiento del EB dentro de la carcasa. Después de la colocación de EBS y la eliminación de la solución de sacarosa, la cáscara se llena con OCT comenzando desde los bordes, siempre teniendo cuidado de evitar que Resus suspenda ebs.
Las burbujas restantes se eliminan con una pipeta y las cáscaras se agitan durante 15 minutos. Después de la agitación. El bloque OCT se congela en hielo seco.
En este punto, puede almacenar el bloque envuelto en papel de aluminio a menos 80 grados centígrados para un análisis más detallado o proceder al criostato Parte cuatro, Corte. Para hacer las secciones criogénicas, necesitará una cuchilla desechable o permanente, OCT y portaobjetos de vidrio pretratados con poli L lisina. El bloque OCT se retira del congelador y se mantiene dentro del criostato hasta que alcanza los 20 grados centígrados bajo cero.
A continuación, el bloque se coloca en el soporte y se alinea en paralelo al borde de la hoja. Las muestras de EB son mucho más pequeñas que la mayoría de las otras muestras de tejido, por lo que es muy importante asegurarse de que toda la superficie del bloque toque la hoja al mismo tiempo, minimizando así la pérdida de material. Una vez colocado, el bloque se corta en rodajas de 10 micrómetros, que se recogen directamente en los portaobjetos de vidrio.
Los portaobjetos pueden almacenarse, preferiblemente a menos 70 grados centígrados, o también pueden usarse el mismo día. El material se puede teñir para inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Conclusión. El método descrito en este documento proporciona un protocolo razonablemente barato y fácil de seguir para obtener secciones delgadas de criostato de cuerpos embrionarios desarrollados a partir de linajes de células madre H nine humanas o US P one de ratón.
Las secciones criogénicas resultantes se pueden utilizar en una amplia variedad de procedimientos para analizar la expresión de proteínas o la morfología de EB.
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Visión general
Este artículo demuestra el proceso de obtención de criosecciones de alta calidad de cuerpos embrionarios (EBs) derivados de células madre pluripotentes cultivadas en suspensión. Estas criosecciones son esenciales para estudiar los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis mientras se mantiene la organización de los EBs.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología de células madre
- Embriogénesis
- Diferenciación celular
Antecedentes
- Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en varios tipos de células.
- Los cuerpos embrionarios son agregados que imitan el desarrollo embrionario temprano.
- Estudiar los EBs ayuda a entender los mecanismos de la embriogénesis.
- Las criosecciones de alta calidad son cruciales para el análisis detallado.
Propósito del estudio
- Proporcionar un método para preparar criosecciones de EBs.
- Facilitar el estudio de procesos celulares y moleculares durante la diferenciación.
- Preservar la organización estructural de los EBs en el análisis.
Métodos utilizados
- Preparación de células madre pluripotentes en cultivo en suspensión.
- Inducción de la diferenciación en cuerpos embrionarios.
- Técnicas de criosección para obtener muestras de alta calidad.
- Análisis de características celulares y moleculares de los EBs.
Principales resultados
- Preparación exitosa de criosecciones de EBs.
- Preservación de la organización de EB en las criosecciones.
- Mayor capacidad para estudiar la embriogénesis a nivel celular.
- Método demostrado que puede aplicarse a varios contextos de investigación.
Conclusiones
- El método permite un análisis detallado de los EBs.
- Las criosecciones de alta calidad son valiosas para estudios embrionarios.
- Este enfoque puede avanzar en la comprensión de la diferenciación de células madre.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
