Evaluación de la frecuencia de mutaciones en bacterias mediante el ensayo de beta-glucosidasa

Tome un cultivo de bacterias modificadas genéticamente.

Las bacterias son inducidas a expresar una variante mutante de la ADN polimerasa con una actividad de corrección defectuosa, lo que aumenta las posibilidades de error de replicación.

Estos errores pueden conducir a mutaciones espontáneas en la región reguladora, que desreprimen el gen de la beta-glucosidasa y desencadenan la expresión de la enzima beta-glucosidasa.

Recolecte muestras a intervalos de tiempo regulares y evalúe el número de generaciones bacterianas en cada cultivo. Centrifugar las muestras y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el gránulo en un tampón.

Agregue una solución permeabilizante y mezcle para permeabilizar la membrana bacteriana.

Transfiera las muestras bacterianas permeabilizadas a una placa de pocillos múltiples.

Agregue un sustrato que ingrese a las bacterias y reaccione con la enzima beta-glucosidasa, produciendo un producto coloreado.

Mida la intensidad del color para determinar la actividad de la beta-glucosidasa.

Analizar la actividad de la beta-glucosidasa en los cultivos bacterianos para determinar la frecuencia de mutación a través de generaciones.

Transfiera una sola colonia de E. coli TOP10 qu