Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:01 min. • November 28th, 2025
Comienza con una placa PCR que contiene una solución desnaturalizante a base de formamida.
Añade los amplicones de PCR diluidos derivados de una bacteria patogénica de peces en cada pozo.
Estos amplicones contienen repeticiones tándem de número variable marcadas con fluorescencia (VNTR), secuencias cortas y repetitivas utilizadas como marcadores genéticos para la identificación bacteriana.
Sella la placa y la centrífuga para eliminar las burbujas de aire.
Calienta la placa en un ciclador térmico para desnaturalizar los VNTR de doble hebra.
La formamida mejora la separación de los hilos e inhibe el recocimiento.
Enfría rápidamente la placa para estabilizar el ADN monocatenario.
Centrifugar para recoger el volumen de la muestra.
Quita el sello y asegura la placa con un marco.
Coloca el tubo capilar y realiza electroforesis capilar.
Durante la electroforesis, los fragmentos de VNTR migran a través del capilar bajo un campo eléctrico y se separan por tamaño.
Un láser excita las etiquetas fluorescentes de cada fragmento, produciendo señales codificadas por colores.
El electroferograma resultante muestra patrones de pico de VNTR que corresponden a la bacteria patógena.
Tras confirmar los amplicones de PCR, utiliza nuevas tiras o placas de PCR para diluir productos de PCR de 1 a 10 en agua purificada. Vórtice y centrífuga brevemente. Mientras trabajas en una armaria de humos, prepara una mezcla maestra en un tubo de centrífuga que consiste en formamida y solución estándar de tamaño de referencia.
Según el número de productos de PCR a analizar, se utilizan volúmenes de reactivos tal y como se detalla en el manuscrito. Permite un volumen excedente del 10%. Un vórtice breve y distribuye 9,5 microlitros en pozos individuales en una placa PCR adecuada para el sistema de electroforesis capilar disponible.
Luego, añade 0,5 microlitros de producto de PCR diluido. Sella y centrifuga brevemente. Luego, carga la placa que contiene las muestras en un termociclador PCR y desnaturaliza las muestras a 95 grados Celsius durante tres minutos antes de enfriarlas a 4 grados Celsius indefinidamente.
Centrifugar a 1000 g durante un minuto, retirar cuidadosamente el sello y cargar la placa en un sistema de electroforesis capilar calibrado según las instrucciones del fabricante. Realizar el análisis de fragmentos de electroforesis capilar, utilizando reactivos según corresponda al aparato elegido, y ajustar las condiciones de ejecución según la descripción del manuscrito.