Basada en el ADN de especies de peces Protocolo de identificación

El Sistema de Identificación de Especies de Peces es un método simple, rápido y preciso basado en el ADN para identificar las especies de peces presentes en una muestra determinada. Las muestras de pescado se tratan con proteinasa K para liberar ácidos nucleicos en la solución. A continuación, se aísla el ADN genómico de los peces y se amplifica por PCR utilizando cebadores que se unen a las secuencias que se encuentran en todos los genomas de los peces.

A continuación, los productos de PCR se digieren con tres enzimas de restricción diferentes y se resuelven en el bioanalizador Agilent 2100. Las longitudes de los fragmentos producidos en las reacciones de digestión se pueden utilizar para determinar las especies de peces utilizando el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción o el software de coincidencia de patrones RFLP. Hola, soy Rachel Formosa de Agilent Technologies.

Hoy te mostraremos un procedimiento para la identificación de especies de peces basada en ADN. Este procedimiento es un método de detección que le permite identificar las especies de pescado presentes en muestras frescas, congeladas, picadas, cocidas, secas o procesadas de otra manera. Y esto se puede lograr en menos de una jornada laboral.

Utilizamos este procedimiento para estudiar la autenticidad de los productos del mar, que es muy importante para la industria de los productos del mar, ya que la sustitución y el etiquetado incorrecto pueden tener importantes consecuencias económicas, ambientales y de seguridad alimentaria. Además, puede ser especialmente difícil determinar las especies de peces mediante la identificación visual y otros métodos tradicionales. Una vez que se ha procesado un pez, las pruebas de ADN proporcionan un resultado mucho más preciso y fiable.

Así que comencemos. Comience a preparar muestras para la extracción de ADN colocando de 10 a 1000 miligramos de cada muestra de tejido de pescado crudo o cocido en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada pez. Muestree a 220 microlitros de solución de caja de proteinasa recién preparada y pipetee hacia arriba y hacia abajo.

Incubar los tubos a 65 grados centígrados durante 10 minutos después de la centrífuga de incubación durante tres a cinco minutos a 14.000 g para pellets los tejidos no digeridos. A continuación, transfiera cuidadosamente 150 microlitros de cada sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mililitros, evitando cualquier material no digerido en la parte inferior y material aceitoso presente en la parte superior. El sobrenadante se utilizará ahora para la extracción de ADN genómico.

Comience la extracción de ADN genómico agregando 500 microlitros del tampón de unión de ácido nucleico a cada muestra. Esto elevará el volumen total de la muestra a 650 microlitros. Agitar la muestra hasta homogeneizarla.

A continuación, transfiera cada muestra a una copa de centrifugado de unión al ADN que se haya colocado en uno de los dos tubos de receptáculo de mililitros provistos en el kit. Coloca la tapa del tubo en la parte superior de la copa giratoria. Gire las muestras durante un minuto a 14.000 Gs para cargar el ADN en la matriz de la copa de centrifugado.

Después de la centrifugación, retire las tazas de centrifugado, deseche el filtrado y vuelva a colocar las tazas en los tubos del receptáculo. Agregue 500 microlitros de un tampón de lavado con alto contenido de sal. Tape los tubos y vuelva a centrifugar después de la centrifugación.

Deseche el filtrado y, nuevamente, vuelva a colocar las tazas de centrifugado en los tubos del receptáculo. Ahora agregue 500 microlitros de etanol al 80%. Tape el tubo y gírelo a 14, 000 Gs durante un minuto.

Repita el lavado con etanol dos veces más después del tercer lavado en etanol al 80% nuevamente, deseche los filtrados. Vuelva a colocar las tazas de centrifugado en los tubos del receptáculo y esta vez centrifuga durante dos minutos para secar la matriz de fibra. Ahora transfiera las tazas giratorias a tubos de recolección de 1,5 mililitros.

Agregue 100 microlitros de tampón evolution a cada vaso giratorio directamente sobre la matriz de fibra dentro del vaso. A continuación, encaje las tapas de los tubos de recogida en las tazas de centrifugado e incubelas a temperatura ambiente durante un minuto. Después de la incubación, centrifugar las muestras a máxima velocidad durante un minuto.

A continuación, deseche la taza giratoria y tape los tubos. Si se miden las concentraciones de ADN, se esperan concentraciones que oscilan entre cinco nanogramos por microlitro y 500 nanogramos por microlitro. El ADN ahora puede almacenarse a cuatro grados Celsius hasta por un mes para almacenamiento a largo plazo, coloque el ADN a menos 20 o menos 80 grados Celsius.

Realice la PCR utilizando los cebadores y reactivos proporcionados en el kit de reactivos P-C-R-R-F-L-P. De acuerdo con el protocolo escrito adjunto, se recomienda ejecutar cada muestra, incluido el control positivo anti no plantilla por duplicado mientras se ejecuta la PCR. Prepare mezclas maestras de enzimas de restricción para las digestiones con DTE E uno, HAE tres y NL tres combinando los siguientes componentes en orden, 1,5 microlitros de agua destilada estéril, 0,5 microlitros de tampón enzimático 10 x y 0,5 microlitros de enzima 10 x.

Prepare lo suficiente para todas las muestras más un volumen de reacción, el exceso de mezcla de tres reactivos. A continuación, distribuya 2,5 microlitros a cada tubo de reacción etiquetado con la muestra y el nombre de la enzima. Una vez completada la PCR, retire las muestras del termociclador y colóquelas en hielo.

Agregue 2.5 microlitros de cada producto de PCR a cada uno de los tres tubos de digestión de restricción para esa reacción. DDE uno, HAE tres, y NLA tres. Próximo vórtice.

Centrifugar e incubar brevemente las digestiones a 37 grados centígrados durante dos horas. Si es más conveniente, las digestiones también se pueden incubar durante la noche. Después de la digestión, incubar las reacciones a 65 grados centígrados durante 15 minutos.

A continuación, añada un microlitro de EDTA de 60 milimolares a cada tubo para finalizar la reacción y el vórtice. Con el kit de reactivos del bioanalizador Agilent, prepare y cargue el digestión de restricción en los pocillos del chip de ADN A de acuerdo con la guía del kit. Para cada muestra, los tres resúmenes deben cargarse en el mismo chip.

A continuación, agite el chip y cárguelo en la máquina. Una vez finalizada la ejecución, vaya al contexto del ensayo y seleccione la pestaña de resumen del chip. En el campo nombre de la muestra, introduzca un nombre de muestra para los 12 pocillos del chip a fin de identificar las especies de peces para las muestras de ADN de prueba.

Inicie el programa decodificador RFLP haciendo clic en archivo. A continuación, abra el archivo XAD. Se abrirá el cuadro de diálogo abierto.

Ahora seleccione el archivo XAD para el chip de ADN utilizado. Y haga clic en abrir para ver una lista de las muestras cargadas en el chip. Seleccione los tres resúmenes correspondientes a la primera muestra de ADN.

En la columna de enzimas, especifique las enzimas de restricción que se utilizaron en el campo etiquetado como altura máxima mínima como porcentaje del marcador inferior. El valor predeterminado es 10%si es necesario. Este valor puede reducirse para identificar pequeños picos que se omitieron o se elevaron para descartar los picos resultantes de ruido no específico en el electroferograma.

Después de realizar cualquier ajuste en el valor de la altura máxima mínima, haga clic en reintegrar. Ahora haga clic en calc en la parte inferior del cuadro de diálogo. Los datos de longitud de fragmento obtenidos de la ejecución del bioanalizador rellenarán los campos del software.

A continuación, en la lista desplegable de puntuación en la esquina superior izquierda de la pantalla, seleccione dados. Si la muestra de pescado consiste en una sola especie o mezcla de peces, si la muestra puede consistir en una mezcla, la tabla en la parte inferior de la pantalla etiquetada como lista de puntuaciones combinadas. Las mejores especies coinciden en función de los resultados de las tres reacciones de digestión.

Las coincidencias perfectas con una puntuación de uno se resaltan en verde. Las coincidencias cercanas se resaltan en amarillo en la parte superior de la pantalla. El valor de corte inferior designa el tamaño mínimo de fragmento utilizado en el análisis y el valor de tolerancia de coincidencia determina lo cerca que debe estar la longitud de un fragmento del fragmento predicho para que se considere una coincidencia.

El valor que se muestra es la configuración predeterminada y se puede ajustar. Repita estos pasos para el análisis de las muestras de ADN restantes en la punta. Se aislaron, amplificaron y digerieron muestras de ADN de cuatro especies diferentes de peces utilizando el método descrito en este video.

Aquí se muestra un gel bioanalizador que muestra las muestras de digestión de restricción utilizando el Bioanalyzer de Agilent y el decodificador RFLP. Aquí se utilizan patrones de flexión de software para identificar a los peces. La primera muestra se identifica correctamente como trucha, la segunda como atún, la tercera como suelo de roca.

Y la última muestra como bacalao específico. Acabamos de mostrarle cómo realizar la identificación de especies de peces basada en el ADN utilizando el método P-C-R-R-F-L-P de agilent. Al realizar este procedimiento, es importante evitar la contaminación cruzada de las muestras, ya que el método es muy sensible.

Así que eso es todo. Ahora ya sabe cómo identificar de forma rápida, sencilla y precisa las especies de peces presentes en sus muestras. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.