Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético
30 de marzo de 2011
Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de Scorrano Et al. (2007). El procedimiento de aislamiento mitocondrial requiere aproximadamente 2 horas. La respiración mitocondrial se puede completar en aproximadamente 1 hora.
El objetivo general de este procedimiento es aislar las mitocondrias y realizar la respiración mitocondrial. Esto se logra aislando primero el músculo esquelético de las ratas rociadoras. A continuación, se homogeneiza el músculo y se aíslan las mitocondrias por centrifugación.
A continuación, se determina la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford. Por último, la respiración mitocondrial se mide mediante poligrafía. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el consumo de oxígeno a través de los diferentes estados de respiración mitocondrial.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del músculo esquelético, como el efecto de diferentes intervenciones de la función mitocondrial. Aunque este método puede proporcionar información sobre el metabolismo del músculo esquelético, también se puede aplicar a otros órganos como el hígado, el cerebro, el riñón o casi cualquier tejido. Para aislar el músculo esquelético, prepare las siguientes soluciones, P-B-S-P-B-S más 10 milimolares de EDTA, ocho veces tampón de aislamiento mitocondrial tampón uno o IB uno, tampón de aislamiento dos o IB dos y tampón experimental o eb.
Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener instrucciones. A continuación, encienda la centrífuga y ajústela a cuatro grados centígrados. Enciende un baño de agua y ajústalo a 37 grados centígrados.
En un cubo bonito, ponga tres vasos de precipitados de 10 mililitros, un codo de alfarero, molinillos de tejido de gemas, unas tijeras quirúrgicas pequeñas y 10 tubos de microcentrífuga en hielo. Todo debe permanecer helado durante todo el experimento. Coloque IB uno e IB dos en ICE y EB en un baño de agua tibia.
A continuación, añada las siguientes soluciones a los tres vasos de precipitados sobre hielo: un vaso de precipitados de PBS, dos vasos de precipitados de 10 mililitros de P-B-S-E-D-T-A. Tres. Tres mililitros de ib. Uno sacrifica a una rata de acuerdo con los procedimientos aprobados por su comité institucional local de cuidado de animales y jugos.
A continuación, aísle rápidamente de 250 a 500 miligramos de músculo esquelético con fórceps y tijeras de Mayo Clinic. Enjuágalo en la beca uno, luego transfiérelo a la beca dos, para homogeneizar el músculo. Primero, transfiéralo al vaso de precipitados tres y finalmente píquelo con unas tijeras.
Transfiera la solución al homogeneizador de gemas Elva potter, homogeneice el músculo usando un mortero motorizado 10 veces, manteniendo el tubo en hielo en todo momento. A continuación, transfiera el homogeneizado a una microcentrífuga preenfriada de dos mililitros, tubos y centrífuga a 700 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante S a un nuevo tubo de microcentrífuga prearchivado y deseche la centrífuga de pellets.
El sobrenadante S a 10, 500 Gs durante 10 minutos A cuatro grados centígrados, transfiera el SNAT a un nuevo tubo de microcentrífuga precargado y etiquételo con SN one y tipo de músculo Reese. Suspenda el pellet en 500 microlitros de IB dos, luego centrifugue a 10, 500 Gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el supinato a un nuevo tubo de microcentrífuga precargado y etiquételo con SN dos y tipo de músculo.
Suspender el pellet mitocondrial final en 100 microlitros de IB dos. Gíralo en una mini fuga durante unos segundos. Si hay un pellet, transfiera el supinato a un nuevo tubo de microcentrífuga precargado y deseche el pellet La calibración del electrodo de oxígeno es un paso clave en este protocolo y debe realizarse a diario.
La calibración del electrodo puede completarse durante el aislamiento mitocondrial. Para comenzar, agregue 100 mililitros de agua destilada a una estrella de matraz de 250 mililitros vigorosamente durante 20 minutos. Para equilibrar el agua con el gas atmosférico, cubra el electrodo GRAT con unas gotas de cloruro de potasio al 50%.
A continuación, coloque un pequeño trozo de papel de liar rizla azul encima del electrodo. A continuación, un trozo de membrana de PTFE. Encima del papel de liar.
Aplique el anillo interior con el aplicador de anillo y, a continuación, coloque el anillo exterior en la ranura del electrodo. Conecte los electrodos y ensamble la base del anillo de plástico más grande, la cámara mitocondrial y las mangueras de agua. Encienda las cajas GRAT e inicie el software GRAS.
Agregue el agua equilibrada a la cámara mitocondrial. Luego agregue una barra de agitación para encender la barra de agitación. Haga clic en hardware.
A continuación, remueve una velocidad. Ajuste la velocidad a 60 y haga clic en. A continuación, comience un nuevo experimento.
Haga clic en calibrar y luego en calibración en fase líquida. Para la caja uno, cambie la temperatura a 37 grados centígrados y haga clic en OK dos veces. Cuando la anulación cambie a, OK, haga clic en ella y abra el tanque de gas nitrógeno.
Coloque la punta conectada al tanque de nitrógeno en la cámara y establezca cero oxígeno. Haga clic en Aceptar cuando cambie de anulación. Aspirar el agua y añadir 500 microlitros de EB a las cámaras mitocondriales.
Selle la cámara con un émbolo. Si utiliza varias cajas, repita el paso de calibración para cada caja. Inicie un nuevo experimento y déjelo funcionar durante aproximadamente un minuto.
Para estabilizar la señal, agregue el volumen necesario de la suspensión de mitocondrias para llegar a 150 microgramos en cada cámara. Marque el evento y déjelo ejecutar. Durante un minuto, agregue 10 microlitros de glutamato tibio de 250 milimolares, malato de 125 milimolares para una concentración final de cinco milimolares de glutamato, marca de malato de 2,5 milimolares, y déjelo correr durante un minuto.
Esto se define como el estado dos. A continuación, agregue 7,5 microlitros de 10 milimolares a DP para una concentración final de 150 micromolares. Luego marque y déjelo correr durante 30 segundos.
Esto se define como el estado tres. Añade otros 7,5 microlitros de 10 milimolares una marca DP, y déjalo correr durante 1,5 minutos. Agregue 0,5 microlitros de oligomicina fría de 10 milimolares para una concentración final de una marca micromolar y déjela actuar durante tres minutos.
Esto se define como el estado cuatro. Añadir un microlitro de FCCP frío de 0,1 milimolares para una concentración final de 0,2 micromolares y dejar reposar durante tres minutos. Esto se define como el estado cinco.
Cuando termine, finalice el experimento y guárdelo. Adquiera las tasas de respiración utilizando el software de la balsa. Introduzca el factor de normalización.
Si se añaden 150 microgramos de proteína mitocondrial, el factor de normalización será de 0,15. Calcule las tasas de respiración normalizadas para los diferentes estados de respiración. Calcule la relación de control respiratorio o RCR dividiendo el estado tres por el estado cuatro.
Esta figura muestra un trazado representativo del consumo de oxígeno por el músculo esquelético. Mitocondria. Una vez estabilizada la señal del electrodo, la muestra de mitocondrias se añade a la cámara GRAT. En el segundo estado, la respiración comienza con la adición de glutamato y malato.
La adición de A DP aumenta el consumo de oxígeno. Definiendo el estado tres. Respiración Una síntasa TP se bloquea mediante la adición de una micina liga para obtener la respiración en estado cuatro.
Por último, se añade FCCP para desacoplar la respiración mitocondrial. Este diagrama muestra las tasas representativas de consumo de oxígeno para los estados 2, 3, 4 y cinco. Para cada experimento se calcula el índice de control respiratorio o RCR.
Un RCR mayor que cuatro se considera evidencia de una preparación viable de mitocondrias al intentar este procedimiento. Es importante mantener las muestras mitocondriales en hielo en todo momento. Siguiendo este procedimiento.
Se pueden realizar otros métodos, como las transferencias de Western, para responder a preguntas adicionales, como el contenido de proteínas mitocondriales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar el músculo mitocondrial del músculo esquelético, así como la respiración mitocondrial.
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Descripción general
Este protocolo describe un procedimiento para aislar mitocondrias de músculos esqueléticos y medir su respiración. El método permite evaluar la función mitocondrial mediante el análisis del consumo de oxígeno.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Metabolismo
Antecedentes
- Las mitocondrias desempeñan un papel crucial en la producción de energía.
- Comprender la respiración mitocondrial es esencial para estudiar los trastornos metabólicos.
- Este protocolo se adapta de metodologías establecidas.
- El aislamiento de mitocondrias es fundamental para la medición precisa de su función.
Objetivo del estudio
- Aislar mitocondrias de tejido muscular esquelético.
- Medir las tasas de respiración mitocondrial.
- Analizar el consumo de oxígeno en diferentes estados de respiración mitocondrial.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de músculo esquelético de ratas sometidas a secado por aspersión.
- Homogeneización del tejido muscular.
- Centrifugación para aislar mitocondrias.
- Determinación de la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford.
- Medición de la respiración mitocondrial utilizando poligrafía.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de mitocondrias a partir de músculo esquelético.
- Evaluación cuantitativa de la respiración mitocondrial.
- Los resultados indican un consumo variable de oxígeno en diferentes estados respiratorios.
Conclusiones
- El protocolo aísla eficazmente mitocondrias para estudios de respiración.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la función mitocondrial en procesos metabólicos.
- Este método puede aplicarse a investigaciones adicionales en el metabolismo muscular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar mitocondrias funcionales del músculo esquelético permite reducir mecanismos de riesgo de dianas metabólicas en descubrimientos preclínicos. Las mediciones cuantitativas de la respiración proporcionan confianza predictiva para la validación de dianas y el análisis de vías metabólicas. Este método apoya decisiones tempranas de avance o interrupción del proyecto al establecer umbrales de viabilidad mitocondrial antes del cribado de compuestos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la función mitocondrial con el metabolismo del músculo esquelético y la homeostasis energética.
- Valor operativo: Permite la desactivación biológica mediante el aislamiento estandarizado de mitocondrias viables con una relación de control respiratorio (RCR) ≥4 como referencia funcional.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al cuantificar las relaciones de control respiratorio que reflejan la integridad mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas mitocondriales validados para ensayos bioquímicos y funcionales posteriores, incluyendo actividad enzimática y proteómica.
- Valor operativo: Asegura la estandarización de ensayos mediante la calibración diaria del electrodo de oxígeno y la normalización consistente de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.
- Valor de escalabilidad: Permite la evaluación confiable de compuestos mediante mediciones reproducibles de la respiración en los estados 2-5 bajo condiciones controladas de sustrato e inhibidor.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia para la enfermedad al estudiar la respiración mitocondrial en el músculo esquelético, un tejido clave en los trastornos metabólicos.
- Valor operativo: Proporciona continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la medición cuantitativa del consumo de oxígeno en diferentes estados respiratorios.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones al medir la respiración desacoplada (estado 5) y la ligada a ATP (estado 3) para evaluar la salud bioenergética.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, apoyando programas dirigidos a las mitocondrias en enfermedades metabólicas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de mitocondrias para esclarecer las vías implicadas en la síntesis de ATP y la señalización metabólica.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante mediciones reproductibles de la respiración que facilitan la comparación de los efectos de compuestos sobre el consumo de oxígeno.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas (respiración en los estados 2-5, RCR) que ayudan a los equipos a comparar condiciones y evaluar la función mitocondrial.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar datos funcionales de mitocondrias relevantes para modelos de metabolismo muscular y gasto energético.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de aislamiento y respiración aplicable a diversos tipos de músculo esquelético y adaptable a otros tejidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la viabilidad mitocondrial, reducción de la ambigüedad mecanicista en los estudios del metabolismo energético.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de los ensayos de aislamiento mitocondrial y respiración.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías en programas de dianas metabólicas.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en ratios de control respiratorio y perfiles de respiración específicos por sustrato.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de aislamiento mitocondrial, centrifugación y medición de la respiración.
- Depende de instrumentos como homogeneizadores, centrífugas mantenidas a 4°C, baños de agua a 37°C y sistemas con electrodo polarográfico de oxígeno.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de tampones, la calibración diaria del electrodo y el manejo estricto de las muestras bajo condiciones de hielo.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen el ajuste de la cantidad de músculo (250-500 mg) y de la carga de proteína mitocondrial (150 µg) según el tipo de músculo esquelético.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de reactivos frescos, una ventana corta para el estudio funcional (~1 h después del aislamiento) y la calibración diaria de los electrodos de oxígeno.
