Name: Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a aislar mitocondrias del músculo esquelético y medir su respiración mediante poligrafía. Este método permite evaluar el consumo de oxígeno en diferentes estados respiratorios para estudiar el metabolismo celular.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Ojo (R01 EY12998) para FH Andrade.

1. Preparación de tampones <ol><li> Encienda 5804R centrífuga y se puso a 4 ° C. A su vez en baño de agua Isotemp 3006D y se puso a 37 º C. </li><li> Prepare las siguientes soluciones antes de que el aislamiento del músculo: <ul><li> PBS: Disolver tampón fosfato salino (PBS) tabletas en agua destilada (5 comprimidos / litro). Mezclar bien. </li><li> PBS más 10 mM EDTA: Para preparar una solución de 100 ml, añadir 2 ml de 500 mM EDTA y 98 ml de PBS. </li><li> Buffer 8X mitocondrias: 10,28 g de sacarosa, para una concentración final de 0,6 M, 400 mg de ácidos grasos libres de albúmina sérica bovina (BSA) para una concentración final de 0,8%, 2,08 g de HEPES para una concentración final de 160 mM, pH a 7.4 y QS de 50 ml con agua destilada. </li><li> Buffer de aislamiento 1 (IB1): Añadir 200 l de 500 mM EDTA para una concentración final de 10 mM, 0,392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mM, 1,25 ml de buffer 8X mitocondrias pH, a 7.4 y QS a 10 ml con agua destilada. </li><li> Buffer aislamiento 2 (IB2): Añadir 60 l de EGTA 500 mM para una concentración final de 3 mm, 0.392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mM, 1,25 ml de buffer 8X mitocondrias pH, a 7.4 y QS a 10 ml con agua destilada. </li><li> Buffer experimental (EB): añadir 100 ml de 500 mM de MgCl 2 para una concentración final de 5 mM, 0,392 g de D-manitol para una concentración final de 215 mm, 25 l de 2,5 mM KH 2 PO 4 para una concentración final de 6,25 M, 2 l de 100 mM EGTA, para una concentración final de 20 mM, 1,25 ml de solución tampón mitocondrial, el pH a 7.4 y QS de 10 ml con agua destilada. </li></ul></li></ol> 2. Aislamiento de los músculos <ol><li> En un cubo de hielo, poner tres vasos de 10 ml, Potter-Elvehjem molinos tejidos y todo lo necesario de otros instrumentos / suministros en el hielo. Todo debe estar helado durante todo el experimento. </li><li> Lugar IB1 y IB2 en un cubo de hielo y EB en el baño de agua caliente cuando haya terminado. </li><li> En los tres vasos de 10 ml, las soluciones se debe agregar: <ul><li> Matraz de 1: 10 ml de PBS </li><li> Vaso 2: 10 ml de PBS / EDTA </li><li> Vaso de 3: 3 ml de IB1 </li></ul></li><li> Matar a una rata humana, aprobado por el local de Atención de Animales institucional y el empleo. </li><li> Aislar rápidamente 250-500 mg de músculo esquelético, enjuague en el vaso 1, entonces la transferencia de vaso 2. </li></ol> 3. Homogeneización / aislamiento mitocondrial <ol><li> Transferencia de músculo para vaso 3 y finamente picada el músculo con la tijera. </li><li> Transferir la solución a la homogeneizador Potter-Elvehjem. Homogeneizar el músculo con un mortero de motor (un taladro puede hacer el trabajo) 10 veces manteniendo el tubo en hielo en todo momento. </li><li> Transferencia de homogeneizado de pre-enfriado tubos de microcentrífuga de 2 ml y centrifugar a 700 g durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado. Deseche pellet. </li><li> Centrifugar el sobrenadante a 10.500 g durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y SN1 etiqueta (número sobrenadante 1) y el tipo de músculo. </li><li> Vuelva a suspender el pellet en 500 l de IB2. </li><li> Centrifugar a 10.500 g durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y SN2 etiqueta (número sobrenadante 2) y el tipo de músculo. </li><li> Suspender el precipitado final mitocondrial en 100 l de IB2. </li><li> Volver a girar la suspensión definitiva mitocondrial en minifuge durante unos segundos. Si hay una bolita, la transferencia de sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de pre-enfriado y desechar el sedimento. </li><li> Determinar la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford 8. </li></ol> 4. La calibración de electrodos NOTA: La calibración del electrodo durante el aislamiento completo mitocondrial. <ol><li> Añadir 100 ml de agua destilada al matraz de 250 ml. Agitar vigorosamente durante 20 minutos para equilibrar el agua con gas atmosférico. </li><li> Añadir unas gotas de 50% de KCl con el electrodo Oxygraph. </li><li> Coloque un pedazo pequeño de papel azul Rizla rodando en la parte superior del electrodo. </li><li> Coloque un pedazo de membrana PTFE en la parte superior del papel de fumar. </li><li> Aplicar el anillo interior, utilizando el aplicador de anillo y coloque el anillo exterior en la ranura de los electrodos. </li><li> Conectar los electrodos y montar el resto del equipo: más grande base de anillo de plástico, cámara de las mitocondrias, y mangueras de agua. </li><li> A su vez en cajas de Oxygraph y comenzar software Oxygraph. </li><li> Agregue el agua a la cámara de equilibrio mitocondrial. </li><li> Añadir una barra de agitación y gire a una velocidad de 60. </li><li> Comenzar un nuevo experimento. </li><li> Haga clic en calibrar y calibración de fase líquida para el Cuadro 1. Los cambios de temperatura a 37 ° C y haga clic en "Aceptar" dos veces. </li><li> Cuando "Override" cambia a "OK" haga clic en él y abrir el tanque de gas nitrógeno. </li><li> Coloque la punta conectadosal tanque de nitrógeno en la cámara y establecer el oxígeno cero. Haga clic en "Aceptar" cuando se cambia de "anulación". </li><li> Aspirar el agua y añadir 500 l de tampón EB a las cámaras de las mitocondrias. </li><li> Junta de la cámara con el émbolo. </li><li> Si utiliza varias cajas, repita los pasos 11-15 para la calibración de la caja 2. </li></ol> 5. La respiración mitocondrial <ol><li> Iniciar un nuevo experimento, se deja correr durante 1 minuto para estabilizar la señal. </li><li> Añada el volumen necesario de la suspensión mitocondrial (paso 3.11) por 150 g en cada cámara, evento marca, y se deja correr durante 1 minuto. </li><li> Añadir 10 l de agua tibia 250 mM/125 mM de glutamato / malato para una concentración final de 5 mM mM/2.5. Mark y deje correr durante 1 minuto. Esta se define como la etapa 2. </li><li> Añadir 7,5 l de 10 mM de ADP, para una concentración final de 150 M, la marca, y dejar funcionar durante 30 segundos. Esta se define como Estado 3. </li><li> Añadir otro 7,5 l de 10 mM de ADP, la marca, y deje correr durante 1,5 minutos. </li><li> Añadir 0,5 l de oligomicina frío de 10 mm para una concentración final de 1 M, marca, y dejar funcionar durante 3 minutos. Esta se define como Estado 4. </li><li> Añadir 1 l de frío mM FCCP 0.1 para una concentración final de 0,2 M, marca, y dejar funcionar durante 3 minutos. Esta se define como Estado 5. </li><li> Cuando haya terminado, al final experimento y guardar. </li><li> Adquirir las tasas de respiración utilizando el software Oxygraph. </li><li> Introduzca factor de normalización: si la adición de 150 mg de proteína mitocondrial, el factor de normalización será 0,15. </li><li> Calcular las tasas de respiración normalizado para los estados de respiración diferente. </li><li> Calcular la relación de control respiratorio (RCR), dividiendo por el Estado 3 Estado 4. </li></ol> 6. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Muestra un representante de seguimiento del consumo de oxígeno por las mitocondrias del músculo esquelético. Después de la señal del electrodo se haya estabilizado, la muestra de las mitocondrias se añade a la cámara de Oxygraph. Estado 2 de respiración comienza con la adición de glutamato y malato. Además de ADP aumenta el consumo de oxígeno, la definición de estado de tres respiración. ATP sintasa está bloqueada por la adición de oligomicina para obtener el estado 4 de respiración. Por último, FCCP se añade a desacoplar la respiración mitocondrial (estado 5). La Tabla 1 muestra las tasas de consumo de oxígeno representante de los estados 2, 3, 4 y 5. La relación del control respiratorio (RCR) se calcula para cada experimento. RCR ≥ 4 se considera como evidencia de una preparación de mitocondrias viable. <table border="1"><tbody><tr><td> Estados </td><td> Tarifas normalizado </td></tr><tr><td> El estado 2 </td><td> 34.74 </td></tr><tr><td> Estado 3 </td><td> 153,40 </td></tr><tr><td> El estado 4 </td><td> 16.49 </td></tr><tr><td> Estado 5 </td><td> 143,70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9.30 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Las tasas de respiración mitocondrial. Representativeoxygen las tasas de consumo de las mitocondrias del músculo esquelético. Los valores se normalizan a la cantidad de mitocondrias añadido a la cámara. La relación del control respiratorio (RCR) se determina dividiendo el estado 3 en el estado 4. Un RCR ≥ 4 representa una preparación de mitocondrias viable.

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

Se presenta un protocolo para aislar viable mitocondrias de los músculos esqueléticos. Si el rendimiento es un problema, el protocolo puede ser modificado mediante la incubación de los músculos aislados en 5 ml de tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% durante 30 minutos en hielo. Para asegurar la digestión completa del músculo con tripsina, el músculo tiene que ser totalmente picada. Después de la incubación de 30 minutos, la solución PBS/10mM EDTA/0.01% de tripsina debe ser reemplazado por completo con 3 ml de tampón de aislami...

<table><tbody><tr><td>Mezcla de 95 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5 % O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Proveedor local de gases</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica del adenosín 5&amp;#8242;-difosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Papel Blue Rizla</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas de Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcianuro p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno comprimido</td><td>Proveedor local de gases</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenglicol-bis-tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>Ácido graso libre de albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Ácido glutámico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Ratas macho Sprague Dawley</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Disco del electrodo de oxígeno</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oxigrafo</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Oxygraph Plus V1.01</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizadores Potter-Elvehjem</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PTFE (0,0125 mm &amp;#215; 25 mm)</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Broca SKIL 3320</td><td>Tienda de ferretería</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Las mitocondrias son orgánulos que controlan la vida y la muerte de la célula. Participan en las principales reacciones metabólicas, síntesis de la mayor parte de la ATP, y regular una serie de cascadas de señalización 2,3. Los investigadores del pasado y actuales tienen mitocondrias aisladas de tejidos de ratas y ratones, como el hígado, cerebro y corazón 4,5. En los últimos años, muchos investigadores se han centrado en estudiar la función mitocondrial de los músculos esqueléticos. Aquí se describe un método que hemos utilizado con éxito para el aislamiento de las mitocondrias de los músculos del esqueleto 6. Nuestro procedimiento requiere que todos los tampones y reactivos son frescas y la necesidad de 250-500 mg de músculo esquelético. Hemos estudiado las mitocondrias aisladas de gastrocnemio de ratas y ratones y el diafragma y los músculos extraoculares rata. Concentración de proteína mitocondrial se mide con el ensayo de Bradford. Es importante que las muestras se mantendrán mitocondrial helado durante la preparación y que los estudios funcionales se realizará en un plazo relativamente corto (aproximadamente 1 hora). Respiración mitocondrial se mide utilizando la polarografía con un electrodo tipo Clark (sistema Oxygraph) a 37 ° C 7. La calibración del electrodo de oxígeno es un paso clave en este protocolo y debe realizarse diariamente. Mitocondrias aisladas (150 mg) se añadió a 0,5 ml de solución tampón experimental (EB). Estado 2 de respiración comienza con la adición de glutamato (5 mm) y malato (2,5 mM). Entonces, la adenosina difosfato (ADP) (150 M) se añade al estado de inicio 3. Oligomicina (1 M), un bloqueador de la sintasa de ATP-asa, se utiliza para estimar el estado 4. Por último, el cianuro carbonilo p-[trifluorometoxi]-fenil-hidrazona (FCCP, 0,2 M) se añade a measurestate 5, o no enganchados respiración 6. La relación del control respiratorio (RCR), la relación entre el estado 3 al estado 4, se calcula después de cada experimento. Un RCR ≥ 4 se considera como evidencia de una preparación de mitocondrias viable. En resumen, se presenta un método para el aislamiento de las mitocondrias viable de los músculos esqueléticos que pueden ser utilizados en estudios bioquímicos (por ejemplo, la actividad enzimática, inmunodetección, proteómica) y funcionales (respiración mitocondrial).

Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de Scorrano<em&gt; Et al.</em&gt; (2007). El procedimiento de aislamiento mitocondrial requiere aproximadamente 2 horas. La respiración mitocondrial se puede completar en aproximadamente 1 hora.

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Las mitocondrias son orgánulos que controlan la vida y la muerte de la célula. Participan en reacciones metabólicas clave, sintetizan la mayor parte del ATP y ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar mitocondrias y realizar la respiración mitocondrial. Esto se logra primero aislado músculo esquelético de ratas spray dly. A continuación, el músculo se homogeniza y las mitocondrias se aíslan mediante centrifugación. La concentración de proteína se determina entonces utilizando el ensayo de Bradford. Finalmente, la respiración mitocondrial se mide mediante poligrafía. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el consumo de oxígeno a través de los diferentes estados de la respiración mitocondrial.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del músculo esquelético, como el efecto de diferentes intervenciones sobre la función mitocondrial. Aunque este método puede proporcionar información sobre el metabolismo del músculo esquelético, también puede aplicarse a otros órganos como el hígado, el cerebro, el riñón o casi cualquier tejido antes de comenzar el procedimiento. Para aislar el músculo esquelético, prepare las siguientes soluciones: P-B-S-P-B-S más 10 milimolares de EDTA, ocho veces tampón de aislamiento mitocondrial, tampón de aislamiento uno o IB uno, tampón de aislamiento dos o IB do

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Research

Investigación

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Biology

Biología

Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Aquí, se toma una muestra de músculo cuádriceps de un cerdo anestesiado y se aíslan las mitocondrias por centrifugación diferencial. A continuación, se determinan las frecuencias respiratorias de los complejos de cadenas respiratorias mitocondriales I, II y IV mediante respirometría de alta resolución.

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

Las mitocondrias son orgánulos metabólicos clave que exhiben un alto nivel de plasticidad fenotípica en el músculo esquelético. La importación de proteínas del citosol es una vía crítica para la biogénesis de orgánulos, esencial para la expansión del retículo y el mantenimiento de la función mitocondrial.  Por lo tanto, la importación de proteínas sirve como un barómetro de la salud celular.

Medición de la capacidad de importación de proteínas de las mitocondrias del músculo esquelético

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares 

Los estudios bioenergéticos y metabolómicos de las mitocondrias han revelado su papel multifacético en muchas enfermedades, pero los métodos de aislamiento de estos orgánulos varían. El método detallado aquí es capaz de purificar mitocondrias de alta calidad a partir de múltiples fuentes de tejidos. La calidad se determina mediante las proporciones de control respiratorio y otras métricas evaluadas con respirometría de alta resolución.

Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores 

El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

La extensión de la tienda que funciona con...

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

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