Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener la estructura tridimensional del complejo del exosoma mediante el método de inclinación cónica aleatoria. Esto se logra primero depositando una capa delgada de película de carbono sobre la rejilla de carbono perforada para formar el sustrato de soporte del complejo proteico, y como segundo paso, aplicando la tinción. La muestra y el colorante se aplican sobre la rejilla, lo que entierra la muestra en sales de metales pesados.

Posteriormente, se realiza microscopía electrónica para obtener pares de micrografías con inclinación del espécimen. Finalmente, se obtienen resultados que muestran la estructura tridimensional del complejo de exosomas basada en el análisis de imágenes mediante el método de inclinación cónica aleatoria. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque, a veces, la preparación adecuada del espécimen para el método de inclinación cónica aleatoria es difícil, así como el procedimiento de procesamiento de imágenes que sigue a la visualización.

La demostración de este método es fundamental, ya que los pasos de calificación y preparación de la muestra son difíciles de aprender sin una ilustración de la evaluación de la muestra. El principio del método de inclinación cónica aleatoria requiere tomar un par de microfotografías de la misma región de un espécimen dentro del microscopio electrónico. Una imagen se toma del espécimen en una posición sin inclinación, y la otra imagen se toma del espécimen inclinado en un ángulo entre 50 y 70 grados. Mediante el uso del ordenador, el par de microfotografías digitalizadas se coloca lado a lado y se seleccionan imágenes de las mismas partículas en esta ilustración.

Estas imágenes están marcadas con números en coordenadas tridimensionales. Las imágenes de partículas no inclinadas y sus homólogas inclinadas se correlacionan entre sí mediante la dirección del eje de inclinación y el ángulo de inclinación. El alineamiento de las imágenes de partículas no inclinadas lleva las imágenes de partículas inclinadas a sus ubicaciones correspondientes como aMule; utilizando múltiples imágenes de partículas inclinadas que llenan el espacio azimutal, la estructura tridimensional de la molécula puede reconstruirse mediante un algoritmo de proyección inversa. Para fabricar las rejillas primero, prepare una solución de VAR al 0,5 % añadiendo 0,45 gramos de resina de polivinil formal y 90 mililitros de cloroformo a un vaso de vidrio de 100 mililitros.

En una campana extractora, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y disuelva la resina de formvar. Con la ayuda de una pequeña barra de agitación y un agitador magnético, la resina tarda aproximadamente 15 minutos en disolverse. Mientras tanto, limpie las portaobjetos de microscopía previamente limpiados con metanol y con toallitas Kim.

Después de que la resina de formvar se haya disuelto completamente en cloroformo, agregue un mililitro de glicerol al 50 % a la superficie de la solución. Ajustar el volumen de glicerol añadido afecta la densidad de los orificios en el carbón agujereado.

Incline la punta de un ultrasonido dentro de la solución. A una profundidad de aproximadamente una pulgada, use la potencia máxima para sonicar durante un minuto, lo que producirá una emulsión de gotas de glicerol en la forma de nuestra solución. Una sonicación más prolongada provocará un tamaño más pequeño de los orificios en el carbono agujereado.

La solución se vuelve turbia después de este paso. Inmediatamente después del baño de sonicación, se sumergen verticalmente en la emulsión portaobjetos de vidrio limpios. Sáquelos durante un segundo y seque la parte inferior de los portaobjetos utilizando papel de filtro para formar una película plástica delgada sobre la superficie de los mismos.

Después de que el cloroformo se evapore, verifique la densidad y el tamaño de los orificios en la película bajo un microscopio óptico. La condición de preparación descrita aquí debería producir de 10 a 20 orificios en cada cuadrado de una cuadrícula de 400 mallas con diámetros entre tres y cuatro micrómetros. Una vez que las laminillas de vidrio estén secas, corte el borde de la película plástica sobre la superficie de la laminilla.

Flote la película sobre la superficie del agua destilada introduciendo verticalmente la portaobjetos en el agua. La película delgada sobre la superficie del agua puede observarse a un ángulo rasante frente al reflejo de la luz. Coloque rejillas de cobre de 400 mallas sobre la película, una por una, con la superficie lisa de la rejilla hacia abajo.

Tomar la película de plástico con la cuadrícula usando una hoja de papel. Dar la vuelta al papel y dejarlo secar. En una placa de Petri, remojar el papel en metanol para eliminar el glicerol residual en los orificios y dejar que el papel se seque al aire.

Utilice un evaporador de carbono para recubrir las rejillas con una capa de carbono de aproximadamente 20 nanómetros de espesor. Utilice el tiempo de evaporación para controlar el espesor deseado. El espesor puede determinarse por el color gris del carbono en comparación con el color gris de una capa de carbono de espesor conocido.

Sumerja las rejillas con capa de carbono en cloroformo dentro de una placa de Petri de vidrio durante media hora para eliminar la capa de barniz, seguido de secado de las rejillas, lo que da como resultado rejillas de carbono perforadas caseras. A continuación, evapore una capa delgada de carbono de aproximadamente cinco nanómetros de espesor sobre una superficie frescamente escindida de mica. Luego coloque cuidadosamente las rejillas de carbono perforadas sobre un trozo de papel de filtro bajo agua destilada.

En un aparato casero, haga flotar el carbono delgado desde la superficie de la mica sobre la superficie del agua y deposítelo lentamente sobre las rejillas de carbono con orificios. Tome el papel filtro con las rejillas y déjelo secar. En una campana extractora, comience la tinción negativa del complejo de exosomas preparando una solución fresca de formiato de uranilo al 2%.

Como se describe en el procedimiento escrito, cubra el tubo de la solución con un trozo de papel de aluminio para evitar la exposición a la luz; la solución debe utilizarse el mismo día. Someta una rejilla de carbono delgado a una descarga luminiscente mediante un aparato de descarga luminiscente. A continuación, coloque un trozo de parafina limpia sobre la bancada y use una pipeta para colocar tres gotas de 50 microlitros de solución de tinción de formiato de uranilo sobre la parafina. Diluya el complejo de exosomas hasta una concentración de aproximadamente 50 nanomolares utilizando tampón de dilución. Luego, con una pipeta, agregue cuatro microlitros de la proteína diluida sobre la rejilla sometida a descarga luminiscente.

Deje la muestra sobre la rejilla durante un minuto, luego retire la solución residual con un trozo de papel de filtro usando pinzas. Invierta inmediatamente la rejilla sobre la primera gota de tinción y enjuague la rejilla moviéndola hacia adelante y hacia atrás varias veces durante unos 10 segundos. Repita este proceso para cada una de las tres gotas de tinción; después del último enjuague, deje que la tinción permanezca sobre la rejilla durante un minuto adicional.

Luego, retire la tinción con un trozo de papel de filtro. Mantenga una capa delgada de la solución de tinción sobre la superficie de la rejilla y deje secar la rejilla en una campana extractora. Coloque la rejilla de muestra en el portamuestras y luego introduzca el portamuestras en un microscopio electrónico FEI TE nine 12.

Revise la cuadrícula de la muestra con baja magnificación para encontrar los cuadrados mejor teñidos. Un buen cuadrado parece tener una docena de orificios con dimensiones de aproximadamente uno a dos micrómetros y áreas teñidas oscuras en su interior. Active el modo de dosis baja de la interfaz de usuario de FEI y alinee el enfoque de búsqueda y la posición de exposición en el modo de dosis baja.

Configure la búsqueda en modo de fracción con una longitud de cámara de 1,5 metros. Ajuste el enfoque a un aumento de 150 K y configure la exposición a un aumento de 50 K con un tiempo de exposición medido de un segundo. Normalmente, se utiliza una característica reconocible en la cuadrícula en ambos modos, de búsqueda y de exposición, para realizar la alineación.

Busque los orificios con buena tinción en el modo de búsqueda y guarde las ubicaciones. Tome una imagen CCD del cuadrado. Incline la muestra a 55 grados y tome otra imagen.

Compare las dos imágenes e identifique los orificios apareados en las dos micrografías. Incline la platina de nuevo a cero grados. Utilice el kit de baja dosis para tomar imágenes de cada orificio identificado en el modo de búsqueda con alto aumento y un desenfoque de aproximadamente menos 0,7 micrómetros.

Después de haber tomado imágenes de todos los orificios, incline el portaobjetos a 55 grados utilizando el mismo aumento. Tome microfotografías del espécimen inclinado con un desenfoque de aproximadamente menos 1,2 micrómetros. Identifique el par correspondiente de microfotografías inclinadas basándose en los patrones observados en las microfotografías de bajo aumento, utilizando el patrón irregular de las rejillas caseras de carbono agujereado.

Para ayudar a la correlación, elija pares de micrografías con inclinación que presenten partículas distribuidas uniformemente y sin halos alrededor de las partículas. Aquellas micrografías con halos evidentes de tinción alrededor de ellas deben descartarse para procesar los datos. Comience con la configuración del programa en el procedimiento.

Se demostrará el procesamiento de imágenes utilizando el proceso 2D en el paquete EMAN. Para cambiar el formato de la imagen, utilice el paquete iMagic five para realizar el alineamiento 2D y el paquete SPIDER. Para llevar a cabo la reconstrucción y refinamiento 3D, convierta la imagen digital DM3 de Gatan al formato de imagen SPIDER.

Mediante el comando proceso 2D, seleccione los pares de partículas. Utilizando el programa web distribuido en el paquete del programa spider, el programa guarda automáticamente las coordenadas de las partículas y recorta todas las partículas seleccionadas mediante el script spider. El script guarda las pilas de partículas inclinadas y no inclinadas.

Convierta las partículas inclinadas de UN al formato IMAG cinco. Utilizando el programa EM de EM con filtro de banda pasante, filtre y enmascare las partículas inclinadas de UN mediante el comando InCorp prep en IMAG cinco y centre las partículas enmascaradas con filtro de banda pasante usando el comando center. En IMAG cinco, alinee y clasifique iterativamente las partículas en clases homogéneas utilizando un script por lotes que ejecute automáticamente los programas de IMAG cinco.

A continuación, utilice los nombres de MSA en el comando class de IMAG cinco para generar la tabla de búsqueda de las clases de las partículas y genere un archivo de gráficos para los valores de traslación y rotación del alineamiento de cada partícula utilizando el comando header. En iMagic cinco, convierta las partículas alineadas al formato spider usando el programa EM dos EM. Luego, transforme la tabla de búsqueda de clases en archivos de documentos spider.

Los valores de traslación y rotación del alineamiento para cada partícula también se convierten en un archivo de documento spider con filtro de banda, máscara y centrado de las partículas inclinadas, de la misma manera que para las partículas no inclinadas en IMAG cinco, y se genera un nuevo conjunto de datos para las partículas inclinadas centradas. Cree archivos de documento angulares a partir de los documentos de alineamiento multirreferencia generados en IMAG cinco y los archivos DCB producidos por el programa web. Utilice el script de proyección inversa en spider para obtener un modelo inicial para cada promedio de clase.

Finalmente, realice la refinación de la proyección del volumen inicial utilizando el script spider frente a todas las partículas no inclinadas para obtener el volumen final mediante RCT. Se han obtenido aproximadamente 50 reconstrucciones del exosoma. Los volúmenes se generan a partir de partículas inclinadas correspondientes a cada partícula en las 50 clases de partículas no inclinadas.

Utilizando la proyección inversa implementada en el paquete spider, se realizó entonces la refinación por coincidencia de proyecciones usando estos volúmenes como modelos iniciales, y se generó el volumen tridimensional mostrado del exosoma a una resolución de aproximadamente 18 angstroms. Luego, podemos insertar los modelos atómicos de diferentes partes del complejo en el mapa tridimensional. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo utilizar la RCT para obtener reconstrucciones tridimensionales, desde la generación de una buena red narrativa de especímenes hasta micrografías en paralelo, y finalmente obtener la reconstrucción mediante técnicas de análisis de imágenes. Además del protocolo que describimos aquí, existen varios métodos para obtener las reconstrucciones finales en el análisis de imágenes.

El paso más crítico para obtener una reconstrucción confiable y correcta consiste en trabajar con un espécimen bien preparado.