Name: Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprende a reconstruir en 3D el complejo exosoma de Saccharomyces cerevisiae mediante microscopía electrónica de tinción negativa y el método de inclinación cónica aleatoria. Este protocolo detalla la preparación de especímenes y el análisis de imágenes para obtener estructuras macromoleculares a resolución media.

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Los autores desean agradecer a los miembros de Nogales laboratorio de la Universidad de California-Berkeley en ayudar a establecer los protocolos iniciales y los miembros del laboratorio de Wang en la Universidad de Yale en su ayuda para establecer los protocolos completos. Reconocemos también el personal de la crio-ME de instalaciones y de Alto Rendimiento Centro de Cómputos de la Facultad de Medicina de Yale por su apoyo. HW Smith es una familia Adjudicatario.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

En este artículo se presenta un protocolo detallado de preparación de muestras y reconstrucción tridimensional del complejo exosoma mediante microscopía electrónica de tinción negativa. Usando este método, se obtuvo la reconstrucción en 3D utilizando el método aleatorio inclinación cónica sin ningún conocimiento previo de la estructura. Método aleatorio inclinación cónica no requiere necesariamente de una muestra homogénea, pero la proyección a juego siguientes refinamiento paso necesitaría una muestra homogénea con el ...

<table><tbody><tr><td>Resina de formaldehído de polivinilo</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Formiato de uranilo</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos Superfrost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>Parrilla de 400 mallas, regular</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Recubridor de carbono Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico Tecnai-12</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descargador de plasma</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Recubridor por pulverización catódica SCD 005</td></tr></tbody></table>

electron microscopy sola partícula reconstrucción del complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Microscopía electrónica de una sola partícula (EM) de reconstrucción se ha convertido recientemente en una herramienta popular para conseguir las tres dimensiones (3D), estructura de grandes complejos macromoleculares. En comparación con cristalografía de rayos X, que tiene algunas ventajas únicas. En primer lugar, una sola partícula de EM reconstrucción no es necesario para cristalizar la muestra de proteína, que es el cuello de botella en la cristalografía de rayos X, especialmente para los grandes complejos macromoleculares. En segundo lugar, que no necesita grandes cantidades de muestras de proteínas. En comparación con los miligramos de proteínas necesarias para la cristalización, una sola partícula de reconstrucción EM sólo necesita varios micro-litros de solución de proteína en nano-molar concentraciones, utilizando el método de tinción negativa EM. Sin embargo, a pesar de algunas asambleas macromoleculares con alta simetría, sola partícula EM se limita a una resolución relativamente baja (inferior a una resolución de 1 nm) de muchos ejemplares, especialmente los que no tienen simetría. Esta técnica también es limitada por el tamaño de las moléculas bajo estudio, es decir, 100 kDa para los especímenes con tinción negativa y 300 kDa para congelados-hidratados muestras en general. Para una nueva muestra de estructura desconocida, por lo general utilizan una solución de metales pesados ​​para incorporar las moléculas de tinción negativa. La muestra se examina en un microscopio electrónico de transmisión para llevar dos dimensiones (2D) micrografías de las moléculas. Lo ideal sería que las moléculas de proteína tienen una estructura homogénea en 3D pero presentan diferentes orientaciones en las micrografías. Estas micrografías son digitalizadas y procesadas en los ordenadores como &quot;partículas individuales&quot;. El uso de dos dimensiones y la alineación de las técnicas de clasificación, las moléculas homogéneas en el mismo punto de vista se agrupan en clases. Su promedio de mejorar la señal de formas 2D de la molécula. Después de asignar las partículas con la orientación adecuada relativa (ángulos de Euler), seremos capaces de reconstruir las imágenes de partículas en 2D en un volumen virtual en 3D. En una sola partícula de reconstrucción en 3D, un paso esencial es el de asignar correctamente la orientación adecuada de cada partícula. Existen varios métodos para asignar el punto de vista de cada partícula, incluyendo la reconstitución angular y una inclinación al azar cónica (ECA) el método 2. En este protocolo, que describe nuestras prácticas para conseguir la reconstrucción en 3D del complejo de levadura exosoma con tinción negativa EM y ECA. Cabe señalar que el protocolo de la microscopía electrónica y procesamiento de imágenes sigue el principio básico de la ECA, pero no es la única manera de realizar el método. En primer lugar, describir la manera de integrar la muestra de proteína en una capa de uranilo-Formate con un espesor comparable al tamaño de la proteína, usando una rejilla de carbono perforado cubierto con una capa de película continua de carbono fino. A continuación, la muestra se inserta en un microscopio electrónico de transmisión para recoger Untilted (0 grados) e inclinada (55 grados) pares de micrografías que se utilizará más tarde para el procesamiento y la obtención de un modelo inicial en 3D de la exosoma levadura. Con este fin, llevamos a cabo ensayos clínicos aleatorios y luego refinar el modelo 3D inicial mediante el uso de la proyección correspondiente método de refinamiento 3.

En este artículo se describe un método estándar para obtener una imagen tridimensional (3D) de la reconstrucción de macromoléculas biológicas mediante microscopía electrónica de tinción negativa (EM). En este protocolo, se explica cómo conseguir la estructura 3D del complejo exosoma Saccharomyces cerevisiae con una resolución media, sirviéndose del método al azar cónica reconstrucción de inclinación (ECA).

Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

La reconstrucción mediante microscopía electrónica (ME) de partícula única se ha convertido recientemente en una herramienta popular para obtener la estructura tridimensional (3D) de grandes...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener la estructura tridimensional del complejo del exosoma mediante el método de inclinación cónica aleatoria. Esto se logra primero depositando una capa delgada de película de carbono sobre la rejilla de carbono perforada para formar el sustrato de soporte del complejo proteico, y en un segundo paso, la tinción. La muestra y el colorante se aplican sobre la rejilla, lo que entierra la muestra en sales de metales pesados.Posteriormente, se realiza microscopía electrónica para obtener pares de micrografías con inclinación del espécimen. Finalmente, se obtienen resultados que muestran la estructura tridimensional del complejo de exosomas basada en el análisis de imágenes mediante el método de inclinación cónica aleatoria. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque, a veces, la preparación adecuada del espécimen para el método de inclinación cónica aleatoria es difícil, al igual que el procedimiento de procesamiento de imágenes que sigue a la visualización.La demostración de este método es fundamental, ya que los pasos de calificación y preparación de la muestra son difíciles de aprender sin u

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Investigación

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Biología

Este video describe la técnica para preparar una sección delgada de exosomas incrustados. Estas secciones se pueden teñir e obtener imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión, o TEM, para estudiar las características estructurales de los exosomas.

Seccionamiento, tinción e imágenes TEM de exosomas incrustados: un protocolo para visualizar las características estructurales de los exosomas mediante TEM

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Este artículo presenta un protocolo para el procesamiento de imágenes cryo-EM utilizando la suite de software SPHIRE. El presente protocolo se puede aplicar para casi todos los proyectos EM de partículas individuales que apuntan a la resolución casi atómica.

Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

Este protocolo describe las diferentes técnicas necesarias para microscopía electrónica de transmisión como tinción negativa, seccionamiento ultrafino para estructura detallada y etiquetado para determinar las posiciones de proteínas específicas en exosomas de inmuno-oro.

Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

El análisis de partículas individuales en microscopía crioelectrónica es una de las principales técnicas utilizadas para determinar la estructura de conjuntos biológicos a alta resolución. Scipion proporciona las herramientas para crear toda la tubería para procesar la información adquirida por el microscopio y lograr una reconstrucción en 3D del espécimen biológico.

Análisis crio-EM y de partículas individuales con Scipion

La determinación de la estructura de complejos macromoleculares utilizando crioEM se ha convertido en rutina para ciertas clases de proteínas y complejos. Aquí, se resume esta tubería (preparación de muestras, detección, adquisición y procesamiento de datos) y los lectores se dirigen hacia recursos y variables más detallados que pueden alterarse en el caso de especímenes más desafiantes.

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) se utiliza para eludir el límite de difracción típico de la microscopía de luz y para ver los exosomas a escala nanométrica. Se puede emplear tanto en dos como en tres dimensiones para caracterizar exosomas.

Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa de vesículas extracelulares en tres dimensiones

Este artículo describe cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento crio-EM, es decir, cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3, para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos de una sola partícula para la determinación de estructuras de alta resolución.

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Las septinas son proteínas citoesqueléticas. Interactúan con las membranas lipídicas y pueden sentir, pero también generar curvatura de la membrana a escala de micras. Describimos en este protocolo metodologías in vitro ascendentes para analizar deformaciones de membrana, unión de septina sensible a la curvatura y ultraestructura de filamentos de septina.

Métodos in vitro ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas

El presente protocolo describe un esquema generalizado y fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados de una sola partícula en experimentos crio-EM. Este procedimiento es especialmente útil para obtener un mapa EM de alta calidad para muestras que sufren un sesgo de orientación preferencial debido a la adherencia a la interfaz aire-agua.

Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

Aprende a reconstruir en 3D el complejo exosoma de Saccharomyces cerevisiae mediante microscopía electrónica de tinción negativa y el método de inclinación cónica aleatoria. Este protocolo detalla la preparación de especímenes y el análisis de imágenes para obtener estructuras macromoleculares a resolución media.

Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

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