Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

El objetivo general del siguiente experimento es obtener la estructura tridimensional del complejo exosoma utilizando el método de inclinación cónica aleatoria. Esto se logra depositando primero una fina capa de película de carbono sobre la rejilla de carbono sagrada para hacer el sustrato de soporte para el complejo de proteínas y la tinción como segundo paso. El espécimen y el tinte se aplican sobre la rejilla, que entierra el espécimen en sales de metales pesados.

A continuación, se lleva a cabo una microscopía electrónica para obtener pares de micrografías de inclinación de la muestra. Finalmente, se obtienen resultados que muestran la estructura tridimensional del complejo exosoma a partir del análisis de imágenes mediante el método de inclinación cónica aleatoria. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque a veces es difícil una buena preparación de la muestra para el método de inclinación cónica aleatoria, así como el procedimiento para el procesamiento de imágenes que sigue a la vista.

La demostración de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación del grado y la muestra son difíciles de aprender sin una ilustración de la evaluación de la muestra. El principio del método de inclinación cónica aleatoria requiere tomar un par de micrografías de la misma región de un espécimen dentro del microscopio electrónico. Se toma una imagen del espécimen en una posición no inclinada, y la otra imagen se toma del espécimen inclinado en un ángulo entre 50 y 70 grados Usando la computadora, el par de micrografías digitalizadas se coloca uno al lado del otro y se seleccionan imágenes de las mismas partículas en esta ilustración.

Estas imágenes están marcadas por números en coordenadas tridimensionales. Las imágenes de las partículas no inclinadas y sus compañeras inclinadas se correlacionan entre sí por la dirección del eje de inclinación y el ángulo de inclinación. La alineación de las imágenes de partículas no inclinadas lleva las imágenes de las partículas inclinadas a sus correspondientes como ubicaciones aMule utilizando múltiples imágenes de partículas inclinadas que llenan el espacio azimutal, la estructura tridimensional de la molécula se puede reconstruir utilizando un algoritmo de retroproyección para fabricar las cuadrículas primero, prepare una solución VAR de forma 0.5% agregando 0.45 gramos de resina formal de polivinilo, y 90 mililitros de cloroformo por un vaso de precipitados de vidrio de 100 mililitros.

En una campana extractora, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y disuelva la resina de var. Con el ocho de una pequeña barra de agitación y una agitación magnética, la resina tarda unos 15 minutos en disolverse. Mientras tanto, limpie los portaobjetos de vidrio de microscopía prelimpios en metanol y con toallitas Kim.

Después de la forma, la resina var se disuelve por completo. En cloroformo, agregue un mililitro de glicerol al 50% a la superficie de la solución. El ajuste del volumen del glicerol añadido afecta a la densidad de los agujeros en el carbono sagrado.

Introduce la punta de un ultrasonido en la solución. A aproximadamente una pulgada de profundidad, use la potencia máxima para sonicar durante un minuto, lo que formará una emulsión de gotas de glicerol en forma de nuestra solución. Una sonicación más prolongada provocará un menor tamaño de los agujeros en el carbono sagrado.

La solución se vuelve lechosa después de este paso. Inmediatamente después de la inmersión en sonicación, el vidrio limpio se desliza verticalmente en la emulsión. Durante un segundo, sácalos y seca la parte inferior de los portaobjetos con papel de filtro para formar una fina película de plástico sobre la superficie de los portaobjetos.

Después de que el cloroformo se evapore, verifique la densidad y el tamaño de los orificios en la película con un microscopio óptico. La condición de preparación descrita aquí debe producir de 10 a 20 agujeros en cada cuadrado de una rejilla de malla de 400 con diámetros entre tres y cuatro micrómetros. Una vez que los portaobjetos de vidrio estén secos, corte el borde de la película de plástico en la superficie del portaobjetos.

Haga flotar la película en la superficie del agua destilada sumergiendo verticalmente el portaobjetos en el agua. La delgada película en la superficie del agua se puede observar en un ángulo de mirada contra el reflejo de la luz. Coloque 400 rejillas de cobre de malla sobre la película, una por una con la superficie lisa de la rejilla hacia abajo.

Toma la película de plástico con rejillas con un pedazo de papel. Dale la vuelta al papel y déjalo secar. En una placa de Petri, remoje el papel en metanol para eliminar el glicerol residual en los agujeros y deje que el papel se seque al aire.

Utilice un evaporador de carbono para recubrir las rejillas con una capa de carbono hasta un grosor de aproximadamente 20 nanómetros. Usar el tiempo de evaporación para controlar el espesor deseado. El espesor se puede determinar por el color gris del carbono en comparación con el color gris de una capa de carbono de espesor conocido.

Remoje las rejillas en capas de carbono con cloroformo en una placa de Petri de vidrio durante media hora para eliminar la forma var forma var eliminación, seguido del secado de las rejillas da como resultado rejillas de carbono sagradas caseras. A continuación, evapore una fina capa de carbono de unos cinco nanómetros de grosor sobre una superficie de mica recién escindida. Luego, coloque con cuidado las rejillas de carbón sagradas en un trozo de papel de filtro debajo de agua destilada.

En un aparato casero, haga flotar el carbono delgado de la superficie de mica a la superficie del agua y deposítelo lentamente en las rejillas de carbono sagradas. Toma el papel de filtro con rejillas y déjalo secar. En una campana extractora, comience la tinción negativa del complejo exosoma haciendo una solución fresca de formiato urinario al 2%.

Como se describe en el procedimiento escrito, cubra el tubo de solución con un trozo de papel de aluminio Para evitar la exposición a la luz, la solución debe usarse de la misma manera. El resplandor diurno descarga un carbono delgado sobre una rejilla de carbono completo utilizando un aparato de descarga de incandescente. A continuación, coloque un trozo de perfume limpio en la pipeta de banco tres gotas de 50 microlitros de solución de tinción de formiato de urinario sobre el perfil, diluya el complejo de exosomas a una concentración de aproximadamente 50 nanomolares Utilizando una pipeta tampón de dilución cuatro microlitros de la proteína diluida hasta que la rejilla de descarga de incandescente.

Deje que la muestra permanezca en la rejilla durante un minuto, luego seque la solución residual con un trozo de papel de filtro con pinzas. Voltee la rejilla inmediatamente encima de la primera gota de mancha y enjuague la rejilla moviéndola hacia adelante y hacia atrás varias veces durante unos 10 segundos. Repita este proceso para cada una de las tres gotas de mancha después del último enjuague, deje que la mancha permanezca en la rejilla durante un minuto más.

A continuación, seca la mancha con un trozo de papel de filtro. Mantenga una capa delgada de solución de tinte en la superficie de la rejilla y deje que la rejilla se seque en una campana extractora. Coloque la rejilla de muestras en el portamuestras y, a continuación, coloque el soporte en un microscopio electrónico FEI TE nine 12.

Revise la cuadrícula de muestra con un aumento bajo para encontrar los mejores cuadrados manchados. Un buen cuadrado parece tener una docena de agujeros con dimensiones de uno a dos micrómetros y áreas manchadas oscuras en ellos. Active el modo de dosis baja de la interfaz de usuario de FEI y alinee el enfoque de búsqueda y la posición de exposición en el modo de dosis baja.

Configure la búsqueda en modo de fracción con una longitud de cámara de 1,5 metros. Ajuste el enfoque a un aumento de 150 K y ajuste el expuesto a 50 K con un tiempo de exposición medido de un segundo. Normalmente, se utiliza una característica reconocible en la cuadrícula tanto en el modo de búsqueda como en el de exposición para realizar la alineación.

Encuentre los agujeros con buena tinción en el modo de búsqueda y guarde las ubicaciones. Toma una foto CCD de la plaza. Incline el espécimen a 55 grados y tome otra fotografía.

Compara las dos imágenes e identifica los agujeros emparejados en las dos micrografías. Inclina el escenario hacia atrás a cero grados. Utilice el kit de dosis baja para tomar fotografías de cada orificio identificado en el modo de búsqueda con un aumento alto con un desenfoque de aproximadamente menos 0,7 micrómetros.

Después de haber tomado fotografías de todos los agujeros, incline la platina a 55 grados con el mismo aumento. Tome micrografías del espécimen inclinado con un desenfoque de aproximadamente menos 1,2 micrómetros. Identifique el par de micrografías de inclinación correspondiente basándose en los patrones de las micrografías de bajo aumento utilizando el patrón irregular de las rejillas de carbono sagrado hechas en casa.

Para ayudar a la correlación, elija pares de inclinación de micrografía con partículas de distribución uniforme y sin halos alrededor de las partículas. Aquellas micrografías con halos de manchas evidentes a su alrededor deben descartarse para procesar los datos. Comience con la configuración del programa en el procedimiento.

El procesamiento de imágenes se demostrará utilizando el proceso 2D en el paquete Eman. Para cambiar el formato de la imagen, el paquete iMagic five para hacer la alineación 2D y el paquete de araña. Para realizar la reconstrucción y el refinamiento en 3D, convierta la imagen digital DM three Gatan a formato de imagen de araña.

Con el comando Proceso 2D, seleccione los pares de partículas. Utilizando el programa web distribuido en el paquete del programa spider, el programa guarda automáticamente las coordenadas de las partículas en la caja de todas las partículas seleccionadas utilizando el script de araña. El script guarda las pilas de partículas inclinadas y no inclinadas.

Convierta las partículas inclinadas de la ONU en formato IMAG five. Usando el paso de banda del programa EM dos EM, filtre y enmascare las partículas inclinadas UN usando el comando de preparación InCorp en IMAG cinco y centre las partículas enmascaradas de paso de banda usando el comando central. En imag five, alinee y clasifique las partículas de forma iterativa en clases homogéneas utilizando un script por lotes que ejecuta automáticamente los programas IMAG five.

A continuación, utilice el comando MSA names in class en IMAG five para generar una tabla de búsqueda de clase de las partículas, genere un archivo de trazado para los valores de traslación y rotación de la alineación de cada partícula utilizando el comando header. En iMagic five, convierte las partículas alineadas al formato de araña utilizando el programa EM two EM. A continuación, cambie la tabla de búsqueda de clases en archivos de documentos de araña.

Los valores de traslación y rotación de la alineación para cada partícula también se convierten en un filtro de paso de banda de archivo de documento de araña, enmascara y centra las partículas inclinadas al igual que para las partículas no inclinadas en IMAG cinco, genera un nuevo conjunto de datos para las partículas inclinadas al centro. Cree archivos de documentos angulares a partir de los documentos de alineación de referencias múltiples generados a partir de IMAG five y los archivos DCB generados por el programa web. Utilice el script de retroproyección en la araña para obtener un modelo inicial para cada promedio de la clase.

Finalmente, realice el refinamiento de la proyección del volumen inicial usando el script de araña contra todas las partículas no inclinadas para obtener el volumen final usando RCT. Se han obtenido alrededor de 50 reconstrucciones del exosoma. Los volúmenes se generan a partir de partículas inclinadas correspondientes a cada partícula en las 50 clases de partículas no inclinadas.

Utilizando estos volúmenes como modelos iniciales y el volumen 3D mostrado del exosoma se generó con una resolución adicional de aproximadamente 18 ang, luego podemos agachar los modelos atómicos de diferentes partes del complejo en el mapa 3D. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar RCT para obtener reconstrucciones tridimensionales, desde la generación de una buena cuadrícula narrativa de especímenes hasta micrografías de igual a igual y, finalmente, la obtención de la reconstrucción utilizando técnicas de análisis de imágenes. Además del protocolo que describimos aquí, existen varios métodos para obtener las reconstrucciones finales en el análisis de imágenes.

El paso más crítico para obtener una reconstrucción correcta y confiable es trabajar con un espécimen bien preparado.