El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

El objetivo general de este método es aislar exosomas de la bilis humana para realizar análisis posteriores, incluido el perfil de microARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad hepática, como la detección de un marcador biliar particular para colangiocarcinomas u otras enfermedades biliares. La principal ventaja de esta técnica es que es robusta y repetible.

Para realizar una colangiopancreatografía retrógrada endoscópica, o CPRE, comience colocando al paciente en posición supina. Después de intubar y pasar un duodenoscopio por la boca del paciente, insertarlo en la segunda parte del duodeno e identificar la papila mayor. Canular selectivamente el conducto biliar común insertando un esfinterotoma de triple lumen precargado con una guía hidrofílica de 0,35 pulgadas o 0,9 milímetros.

Bajo guía fluoroscópica, avance la guía hasta el conducto hepático izquierdo y luego avance el esfinterotomo cinco centímetros en el conducto biliar para adquirir una posición estable. Después de quitar la guía, conecte una jeringa de 10 milímetros al puerto de la guía a través del bloqueo inferior y use 10 mililitros de presión negativa para aspirar la bilis. Retire la jeringa que contiene la bilis y, después de volver a insertar la guía, inyecte el agente de contraste a través del puerto de inyección para opacificar el árbol biliar.

Luego, transfiera la bilis recolectada a un tubo de 15 mililitros en hielo y, si se almacena para un tiempo posterior, centrifugue la muestra a 500 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos antes de congelarla a menos 80 grados centígrados. Para proceder inmediatamente con el aislamiento de exosomas, transfiera 400 microlitros de bilis a un tubo de microcentrífuga y centrifugue a 300 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para recolectar células y restos celulares. Para eliminar aún más el sobrenadante, transfiera la solución a tubos de microcentrífuga nuevos y centrifugue las muestras a 16.500 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Luego, en un gabinete de bioseguridad, recoja el sobrenadante en una jeringa y fíltrelo a través de un filtro de membrana de polietersulfona de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier partícula restante de más de 200 nanómetros. Transfiera el sobrenadante filtrado a los tubos de ultracentrífuga y use PBS para llevar los tubos hasta al menos dos tercios de su capacidad para evitar que los tubos colapsen durante la centrifugación. Granular los exosomas mediante ultracentrifugación a 120.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 70 minutos.

Una pequeña bolita amarilla contendrá los exosomas. Deseche el sobrenadante decantando cuidadosamente y desinfecte los residuos añadiendo lejía hasta una concentración final del 10% volumen por volumen. Luego déjalo reposar durante 20 minutos.

Para experimentos posteriores, procese los gránulos en un pequeño volumen de solución apropiada o vuelva a suspenderlos en 50 a 100 microlitros de PBS y almacene a menos 80 grados Celsius para uso futuro. Después de preparar cuadrículas de vesículas extracelulares teñidas con contraste, o EV, de acuerdo con el protocolo de texto, adquiera imágenes con un microscopio electrónico utilizando un voltaje de aceleración de 80 kilovoltios a partir de aumentos de 20.000 X, y aumentando a 100.000 X, al determinar el tamaño de las partículas. Los exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por microscopía regular o citometría de flujo; sin embargo, esta figura muestra los resultados de un análisis típico de seguimiento de nanopartículas, o NTA, de exosomas que miden la concentración y la distribución del tamaño, que promedió 97 nanómetros en esta muestra de bilis humana aislada.

La microscopía electrónica también se puede utilizar para confirmar el tamaño de las partículas aisladas en la bilis humana y esta figura muestra un resultado típico de transmisión electromagnética. Estas transferencias occidentales se sondearon en busca de proteínas enriquecidas en exosomas, como la tetraspanina CD63 y Tsg101. Este gráfico de amplificación en tiempo real muestra una variedad de especies de microARN extraídas de exosomas de bilis humana.

Dado que los exosomas carecen de estándares fiables como el ARN ribosómico 18S o 28S o los genes de mantenimiento, el aumento de un microARN sintético es importante para la normalización. La técnica de aislamiento de Exos se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener y procesar bilis de pacientes o animales para aislar y analizar vesículas extracelulares.

Al retractarse de este procedimiento, es importante recordar centrifugar la muestra a 500 G y cuatro grados antes de congelarla a menos 80, si no puede continuar con la ultracentrifugación. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los estudios de microARN, para responder a preguntas adicionales, como los perfiles de microARN. No olvide que trabajar con bilis puede ser extremadamente peligroso ya que podría contener hepatitis, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y gafas de seguridad mientras se realiza este procedimiento.

Después de su desarrollo, la técnica allanó el camino para la investigación en el campo de la investigación del colangiocarcinoma para explorar las vesículas extracelulares como un posible biomarcador en la bilis de pacientes con problemas biliares como la obstrucción del PSA.