El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

El objetivo general de este método es aislar exosomas de bilis humana para realizar análisis posteriores, incluyendo el perfilado de microARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades hepáticas, como la detección de un marcador biliar específico para colangiocarcinomas u otras enfermedades biliares. La principal ventaja de esta técnica es que es robusta y repetible.

Para realizar una colangiopancreatografía retrógrada endoscópica, o CPRE, comience colocando al paciente en posición supina. Después de la intubación y de pasar un duodenoscopio a través de la boca del paciente, insértelo en la segunda porción del duodeno e identifique la papila mayor. Canule selectivamente el conducto biliar común insertando un esfinterotomo de triple luz precargado con un alambre guía hidrófilo de 0,35 pulgadas o de 0,9 milímetros.

Bajo guía fluoroscópica, avance el alambre guía hasta el conducto hepático izquierdo y luego avance el esfinterotomo cinco centímetros dentro del conducto biliar para obtener una posición estable. Tras retirar el alambre guía, conecte una jeringa de 10 mililitros al puerto del alambre guía a través del cierre inferior y utilice 10 mililitros de presión negativa para aspirar la bilis. Retire la jeringa que contiene la bilis y, tras volver a insertar el alambre guía, inyecte agente de contraste a través del puerto de inyección para opacificar el árbol biliar.

Luego, transfiera la bilis recolectada a un tubo de 15 mililitros sobre hielo y, si se va a almacenar para un momento posterior, centrifugue la muestra a 500 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos antes de congelarla a menos 80 grados Celsius. Para proceder inmediatamente con el aislamiento de exosomas, transfiera 400 microlitros de bilis a un tubo de microcentrífuga y centrifugue a 300 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para recolectar las células y los restos celulares. Para eliminar aún más el sobrenadante, transfiera la solución a tubos de microcentrífuga nuevos y centrifugue las muestras a 16.500 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos.

Luego, en una cabina de seguridad biológica, recolecte el sobrenadante en una jeringa y filtre a través de un filtro de membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier partícula restante mayor de 200 nanómetros. Transfiera el sobrenadante filtrado a tubos para ultracentrífuga y use PBS para llenar los tubos hasta al menos dos tercios de su capacidad, con el fin de evitar que los tubos colapsen durante la centrifugación. Pelote los exosomas mediante ultracentrifugación a 120.000 × g y cuatro grados Celsius durante 70 minutos.

Un pequeño pellet amarillo contendrá los exosomas. Deseche el sobrenadante decantando cuidadosamente y desinfecte el residuo agregando hipoclorito de sodio hasta una concentración final del 10% volumen por volumen. Luego, déjelo reposar durante 20 minutos.

Para experimentos posteriores, procese los pellet en un pequeño volumen de solución adecuada o resuspenda en 50 a 100 microlitros de PBS y almacene a menos 80 grados Celsius para uso futuro. Después de preparar las rejillas con vesículas extracelulares teñidas para contraste, o EVs, según el protocolo descrito, adquiera imágenes con un microscopio electrónico utilizando un voltaje de aceleración de 80 kilovoltios, comenzando con aumentos de 20.000 X y aumentando hasta 100.000 X, al determinar el tamaño de las partículas. Los exosomas son demasiado pequeños para ser detectados mediante microscopía convencional o citometría de flujo; sin embargo, esta figura muestra los resultados de un análisis típico de seguimiento de nanopartículas, o NTA, de exosomas que mide la concentración y distribución de tamaño, que en promedio fue de 97 nanómetros en esta muestra de bilis humana aislada.

La microscopía electrónica también puede utilizarse para confirmar el tamaño de las partículas aisladas en la bilis humana y esta figura muestra un resultado típico de microscopía electrónica de transmisión. Estos blottes occidentales se ensayaron para detectar proteínas enriquecidas en exosomas, como la tetraspanina CD63 y Tsg101. Este gráfico de amplificación en tiempo real muestra una variedad de especies de microARN extraídas de exosomas de bilis humana.

Dado que los exosomas carecen de estándares confiables como el ARN ribosómico 18S o 28S o genes de referencia, la adición de un microARN sintético es importante para la normalización. La técnica de aislamiento de exosomas puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener y procesar bilis de pacientes o animales para aislar y analizar vesículas extracelulares.

Al repetir este procedimiento, es importante recordar centrifugar la muestra a 500 G y cuatro grados antes de congelarla a menos 80, si no se puede continuar con la ultracentrifugación. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como estudios de microARN, para responder preguntas adicionales, como los perfiles de microARN. No olvide que trabajar con bilis puede ser extremadamente peligroso, ya que podría contener hepatitis, y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y gafas de seguridad, al realizar este procedimiento.

Tras su desarrollo, la técnica allanó el camino para la investigación en el campo del colangiocarcinoma, al explorar las vesículas extracelulares como posibles biomarcadores en la bilis de pacientes con problemas biliares, como la obstrucción del PSA.