Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

Vamos a describir un método que mide la cinética del transporte de iones de proteínas de membrana junto con el sitio específico de análisis de los cambios conformacionales con fluorescencia en células individuales. Esta técnica se adapta a los canales iónicos, transportadores y bombas iónicas y pueden ser utilizados para determinar las limitaciones distancia entre subunidades de la proteína.

El objetivo general de este procedimiento es examinar la dinámica de confirmación de las proteínas de membrana utilizando el marcaje de fluorescencia dirigida al sitio en la superficie de células individuales. Esto se logra mutando primero individualmente los residuos en la interfaz de los dominios extracelular y transmembrana con la cistina, como lo muestra el C.It rojo, luego es necesario determinar si este residuo puede marcarse con un fluoro cuatro que reacciona con cistina. El segundo paso del procedimiento es examinar si la cistina, la mutagénesis y/o el marcaje con flúor cuatro afectan la cinética o el estado de confirmación de la proteína.

Esto se realiza utilizando la configuración que se muestra. El tercer paso del procedimiento es comparar y contrastar los cambios en la intensidad de la fluorescencia con los parámetros cinéticos de la proteína diana. Aquí se muestra una traza de fluorescencia típica.

El paso final del procedimiento es etiquetar los pares de cisteína mutados con cuatro de flúor del donante o cuatro de flúor del aceptor del donante para medir las tasas de fotodestrucción en conjunto con las mediciones de la pinza de voltaje para determinar las restricciones de distancia. Esta figura muestra las tasas de destrucción de fotos de donantes en ausencia de aceptor en negro, la destrucción de fotos de donantes en presencia de aceptor está en rojo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que los cambios en la intensidad de la fluorescencia, que son el resultado de los cambios de confirmación de proteínas, se pueden correlacionar con la función de las proteínas de membrana a través de la fluorometría de pinza de voltaje.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del transporte de iones de membrana, como por ejemplo cómo los cambios en el estado de confirmación de la proteína facilitan el transporte de moléculas pequeñas e iones a través de la membrana plasmática. Comience el procedimiento clonando la bomba de sodio y potasio en un vector adecuado para xop posts, expresión de ovocitos Lavis. El siguiente paso es realizar mutaciones de cisteína en los residuos ubicados en la interfaz entre los dominios transmembrana y extracelular, como se describe en el artículo adjunto.

Cuando termine, verifique la inserción de la mutación por secuenciación de ADN después de transcribir el ADN plasmático a ARNm como se describe en el artículo adjunto, cuantifique el rendimiento de ARNm utilizando un espectrofotómetro antes de la cirugía. La rana debe estar en ayunas durante 12 horas para evitar vómitos durante la operación. Para comenzar la cirugía al día siguiente, sumerja a la rana en la solución anestésica hasta que la rana deje de responder a un pellizco en el dedo del pie.

Retire la rana de la solución anestésica y colóquela con el lado dorsal hacia abajo en el lado absorbente de una almohadilla para pañales. Coloca una toalla de papel húmeda sobre la rana para mantenerla húmeda. Además, si los ojos de la rana están abiertos, manténgalos húmedos con solución salina.

Haz una pequeña incisión en un lado de la línea media de la rana. Localiza el ovario y llévalo al exterior de la rana. Evite tocar el ovario con la piel.

Retire el ovario y colóquelo en una placa de Petri que contenga una solución de ringer. Revise el tejido restante para ver si hay sangrado antes de volver a colocarlo dentro de la cavidad smic. Si se produce sangrado, aplique presión con un hisopo estéril hasta que se detenga.

Termine la cirugía suturando la incisión con un patrón de sutura interrumpido. Regrese la rana a su alojamiento para recuperarse de la anestesia con unas tijeras. Divida el lóbulo ovárico aislado en partes más pequeñas.

Transfiera los grumos a una solución de timbre más calcio con colagenasa. A continuación, agite suavemente la solución digestiva durante dos horas a 18 grados centígrados. Cuando la mayoría de los citos estén separados, lave los ovocitos con solución de timbre menos calcio.

A continuación, incubar los ovocitos durante 10 minutos en solución de timbre menos calcio a temperatura ambiente. En este punto, lavar los citos exhaustivamente en anillos más solución de calcio. A continuación, transfiera los ovocitos a una solución de ringer más calcio para su almacenamiento antes de la inyección.

Para el siguiente paso, recupere el ARNm sintetizado del congelador a menos 20 grados centígrados. Agregue 25 nanogramos del ARNm a un volumen final de 50 nanolitros. A continuación, inyecte el ARNm en los citos después de la inyección.

Colocar los ovocitos en una solución de timbre y un miligramo por mililitro de gentamicina e incubarlos a 18 grados centígrados en la oscuridad durante tres a siete días. Esto permite que la bomba de sodio y potasio se exprese dentro de la membrana plasmática del ovocito. El día del experimento, retire los ovocitos de la incubadora y colóquelos en un tampón de carga durante 45 minutos y luego en un tampón de postcarga durante 45 minutos.

Esto aumenta la concentración de sodio intracelular para facilitar la medición de la bomba de sodio y potasio. Para las mediciones de fluorescencia, incube los citos en un tampón de carga posterior que contenga cinco micromolares del fluoróforo deseado, como TMRM o FM durante cinco a 10 minutos en la oscuridad. Después del marcaje de la flora cuatro, lavar los ovocitos exhaustivamente con un post tampón sin colorantes.

Mantenga los ovocitos en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo. Para prepararse para las mediciones de pinza de voltaje de dos electrodos, comience llenando los microelectrodos con cloruro de potasio de tres molares y probando la resistencia. La resistencia debe estar entre 0,5 y 1,5 mega ohmios.

Para los experimentos de barrido con cisteína, equipe el microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación 5 35 DF 50, un filtro de emisión 5 65 EFLP y un espejo diic 5 70 DRLP. A continuación, coloque el octe en una cámara RC 10 en la platina del microscopio fluorescente. A continuación, inserte suavemente ambos microelectrodos en el octe utilizando el amplificador para mantener el potencial de membrana a un valor constante.

Mida el flujo de iones a través de la membrana activando la proteína utilizando una técnica adecuada, como el intercambio de soluciones o el cambio del potencial de membrana. Para mediciones de fluorescencia simultáneas, utilice una fuente de luz de tungsteno de 100 vatios para excitar el fluoróforo donante y para pin 0 2 2, A photo DDE para detectar cambios en la intensidad de fluorescencia para el marcaje fluorescente. Después de la gammagrafía con cisteína.

Mida el cambio en la intensidad fluorescente a la corriente estacionaria utilizando pasos de voltaje que son controlados por el software P clamp 10. Una segunda parte del protocolo consiste en tomar mediciones de la atropía del anas junto con mediciones de distancia. Para calcular el rango de valores kappa cuadrado, una atropía mide la movilidad relativa del fluoro cuatro debido a la rotación.

Consulte el artículo adjunto para obtener más información sobre los cálculos. Para medir las restricciones de distancia, use una holoenzima, que tiene dos residuos de cisteína extracelular accesibles que se pueden marcar con fluoro cuatro. Agregue un tampón de post-carga que contenga un FM micromolar y cuatro TMRM micromolares.

Es decir, el donante y el aceptante. Fluoro cuatro a un lote de ovocitos añaden un micromolar FM solamente. Eso es solo el flúor del donante.

Cuatro lotes más de ovocitos incuban ambos lotes de ovocitos en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Esto permite realizar mediciones de enzimas hollo marcadas con y sin un aceptor de fluoro cuatro. A continuación, equipe el microscopio con un filtro de excitación 4 75 DF 40, un filtro de emisión 5 30 DF 30 y un espejo dicroico 5 0 5 DRLP.

A continuación, coloque el ovocito en la cámara de la platina del microscopio de fluorescencia. El mantenimiento de un flujo continuo de solución mide la dependencia del tiempo del blanqueo donante en presencia y ausencia de la flora aceptora. Cuatro. Estos resultados se pueden utilizar para calcular la distancia entre los dos residuos en la bomba de sodio y potasio utilizando silvicultores.

Ecuación dos: las mediciones de la pinza de voltaje del electrodo deben realizarse simultáneamente para garantizar que la proteína sea funcional. El uso de la función de pinza X en la pinza P 10 promedió los resultados de la fotodestrucción del donante de fluoro cuatro para un mínimo de cuatro grabaciones en el sitio. Para medir el movimiento relativo de las subunidades de proteínas, utilice construcciones de cisteína doble que contengan cuatro fluoro aceptores y donantes.

La intensidad de fluorescencia en estos residuos es insensible al estado de confirmación de la proteína y estará en función de la distancia entre los dos cuatro. A continuación, cambie el conjunto de filtros en el microscopio a un filtro de excitación 4 75 a F 40, un filtro de emisión 5 95 a F 60 y un espejo dicroico 5 0 5 DRLP. A continuación, coloque el OI en la cámara de la platina del microscopio de fluorescencia.

A continuación, el donante se excita con una fuente de luz de tungsteno de 100 vatios y la intensidad de fluorescencia del aceptor. El fluorocuatro se mide utilizando un método apropiado, como un ligando de voltaje o un intercambio de solución, activa la proteína de membrana y mide simultáneamente el cambio en la intensidad de la fluorescencia. Esta figura muestra la correlación del transporte de iones a través de la membrana celular y los cambios en la intensidad de la fluorescencia.

La traza superior muestra las mediciones de la pinza amperimétrica en presencia de solución de prueba de sodio y solución de prueba de potasio en presencia de 10 micromolares y 10 milimolares. La traza inferior muestra cambios en la intensidad de fluorescencia medidos en conjunto con las mediciones de la pinza amperimétrica. Esta figura muestra dos ovocitos marcados con TMRM, el aceptor fluoro cuatro.

El ovocito de la izquierda expresa atpa de sodio y potasio de tipo salvaje, mientras que el ovocito de la derecha expresa APA de potasio y sodio con un residuo de cisteína accesible. Las trazas superiores de esta figura muestran datos de corriente transitoria al pulso de voltaje. Las trazas inferiores muestran registros en tiempo real de los cambios de intensidad de fluorescencia al pulso de voltaje.

Esta figura muestra la dependencia del tiempo del fotoblanqueo, la fotodestrucción del donante se mide en ausencia y presencia de aceptor fluoro cuatro. Cada seguimiento es el promedio de cuatro grabaciones del sitio oh. Esta figura muestra el movimiento relativo de las subunidades tras los cambios de confirmación.

Los cambios de fluorescencia se muestran en las trazas rojas y el flujo de corriente se muestra en las trazas negras. Un aumento en la intensidad de fluorescencia que se muestra a la izquierda indica que los pisos de flora se acercan. Ningún cambio en la intensidad de la fluorescencia que se muestra en el centro indica que la distancia de Fluor cuatro permanece estática.

Una disminución en la intensidad de fluorescencia que se muestra a la derecha indica que los cuatro fluorados se separan más al intentar este procedimiento. Es importante recordar correlacionar los cambios en la intensidad cinética y de fluorescencia en estado estacionario con los cambios de confirmación en la proteína.