Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

El objetivo general de este procedimiento es examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana mediante el etiquetado fluorescente dirigido a sitios específicos en la superficie de células individuales. Esto se logra primero mutando individualmente residuos en la interfaz de los dominios extracelular y transmembranal a cisteína, como se muestra con la C roja. Luego, es necesario determinar si este residuo puede etiquetarse con un fluoróforo reactivo hacia la cisteína. El segundo paso del procedimiento consiste en examinar si la mutagénesis de cisteína y/o el etiquetado con el fluoróforo afectan la cinética y/o el estado conformacional de la proteína.

Esto se realiza utilizando el montaje mostrado. El tercer paso del procedimiento consiste en comparar y contrastar los cambios en la intensidad de fluorescencia con los parámetros cinéticos de la proteína diana. Aquí se muestra un trazado típico de fluorescencia.

El paso final del procedimiento consiste en marcar pares de cisteínas mutadas con fluoróforos donadores o fluoróforos donadores y aceptoras para medir las tasas de fotodestrucción en paralelo con mediciones de bloqueo de voltaje, con el fin de determinar las restricciones de distancia. Esta figura muestra las tasas de fotodestrucción del donador en ausencia del aceptor en negro; la fotodestrucción del donador en presencia del aceptor se muestra en rojo. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que los cambios en la intensidad de fluorescencia, resultado de cambios conformacionales en la proteína, pueden correlacionarse con la función de proteínas de membrana mediante fluorometría con bloqueo de voltaje.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del transporte iónico a través de membranas, como cómo los cambios en el estado conformacional de la proteína facilitan el transporte de moléculas pequeñas e iones a través de la membrana plasmática. Comience el procedimiento clonando la bomba de sodio-potasio en un vector adecuado para la expresión en ovocitos de Xenopus. El siguiente paso consiste en introducir mutaciones de cisteína en residuos ubicados en la interfase entre los dominios transmembrana y extracelulares, tal como se describe en el artículo adjunto.

Una vez finalizado, verifique la inserción de la mutación mediante secuenciación de ADN tras transcribir el ADN plasmídico a ARNm según se describe en el artículo adjunto, y cuantifique el rendimiento de ARNm utilizando un espectrofotómetro antes de la cirugía. La rana debe ayunar durante 12 horas para prevenir el vómito durante la operación. Para comenzar la cirugía al día siguiente, sumerja la rana en la solución anestésica hasta que deje de responder a un pellizco en el dedo del pie.

Retire la rana de la solución anestésica y colóquela con el lado dorsal hacia abajo sobre la parte absorbente de una almohadilla para pañales. Coloque una toalla de papel húmeda sobre la rana para mantenerla húmeda. Además, si los ojos de la rana están abiertos, manténgalos húmedos con solución salina.

Realice una pequeña incisión en la línea media de un lado de la rana. Localice el ovario y extráigalo al exterior de la rana. Evite tocar el ovario con la piel.

Retire el ovario y colóquelo en una placa de Petri que contenga solución de Ringer. Revise el tejido restante en busca de sangrado antes de volver a colocarlo dentro de la cavidad abdominal. Si ocurre sangrado, aplique presión con un hisopo estéril hasta que cese.

Termine la cirugía suturando la incisión utilizando un patrón de sutura interrumpida. Devuelva la rana a su alojamiento para que se recupere de la anestesia usando tijeras. Divida el lóbulo ovárico aislado en partes más pequeñas.

Transfiera los agregados a solución de Ringer con calcio más colagenasa. A continuación, agite suavemente la solución de digestión durante dos horas a 18 grados Celsius. Cuando la mayoría de los citos estén separados, lave los ovocitos con solución de Ringer sin calcio.

Luego, incubar los ovocitos durante 10 minutos en solución de Ringer sin calcio a temperatura ambiente. En este punto, lavar exhaustivamente los ovocitos en solución de Ringer con calcio. A continuación, transferir los ovocitos a solución de Ringer con calcio para su almacenamiento previo a la inyección.

Para el siguiente paso, retire el ARN mensajero sintetizado del congelador a menos 20 grados Celsius. Añada 25 nanogramos del ARN mensajero hasta un volumen final de 50 nanolitros. A continuación, inyecte el ARN mensajero en los citos tras la inyección.

Coloque los ovocitos en solución de Ringer con 1 miligramo por mililitro de gentamicina e incúbelos a 18 grados Celsius en la oscuridad durante tres a siete días. Esto permite que la bomba de sodio-potasio se exprese en la membrana plasmática del ovocito. El día del experimento, retire los ovocitos del incubador y colóquelos en tampón de carga durante 45 minutos y luego en tampón postcarga durante 45 minutos.

Esto aumenta la concentración intracelular de sodio para facilitar la medición de la bomba sodio-potasio. Para mediciones de fluorescencia, incubar los citos en un tampón poscarga que contenga cinco micromoles del fluoróforo deseado, como TMRM o FM, durante cinco a 10 minutos en la oscuridad. Después de la marcación con flora cuatro, lavar exhaustivamente los ovocitos con tampón poscarga libre de colorante.

Mantenga los ovocitos en la oscuridad para evitar el blanqueo fotográfico. Para prepararse para las mediciones con el método de voltaje-clamp de dos electrodos, comience llenando los microelectrodos con cloruro de potasio tres molar y probando la resistencia. La resistencia debe estar entre 0,5 y 1,5 megaohmios.

Para experimentos de exploración con cisteína, equipar el microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación 5 35 DF 50, un filtro de emisión 5 65 EFLP y un espejo dicróico cinco 70 DRLP. A continuación, colocar el octe en una cámara RC 10 sobre la platina del microscopio de fluorescencia. Luego insertar suavemente ambos microelectrodos en el octe utilizando el amplificador para mantener el potencial de membrana en un valor constante.

Mida el flujo iónico a través de la membrana activando la proteína mediante una técnica adecuada, como el intercambio de solución o el cambio del potencial de membrana. Para mediciones de fluorescencia simultáneas, utilice una fuente de luz de tungsteno de 100 vatios para excitar el fluoróforo donador y para pin 0 2 2, A photo DDE con el fin de detectar cambios en la intensidad de fluorescencia para la marcación fluorescente. Tras el escaneo de cisteína.

Mida el cambio en la intensidad fluorescente a corriente estacionaria utilizando pasos de voltaje controlados por el software P clamp 10. Una segunda parte del protocolo implica tomar mediciones de atropía junto con mediciones de distancia. Para calcular el rango de valores de kappa cuadrado, una atropía mide la movilidad relativa del fluoro cuatro debido a la rotación.

Consulte el artículo adjunto para obtener detalles sobre los cálculos. Para medir las restricciones de distancia, utilice una enzima holo, que tiene dos residuos de cisteína extracelulares accesibles que pueden marcarse con fluorocromos. Añada tampón postcarga que contenga un micromolar de FM y cuatro micromolares de TMRM.

Ese es el donador y el aceptor. Fluoro cuatro a un lote de ovocitos, añada un micromolar de FM únicamente. Ese es solamente el fluoro donador.

Cuatro a otro lote de ovocitos, incubar ambos lotes de ovocitos sobre hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Esto permite realizar mediciones de enzimas holocromáticas marcadas con y sin un fluoróforo aceptor cuatro. A continuación, equipar el microscopio con un filtro de excitación 475 DF 40, un filtro de emisión 530 DF 30 y un espejo dicróico 505 DRLP.

Luego coloque el ovocito en la cámara sobre la platina del microscopio de fluorescencia. Manteniendo un flujo continuo de solución, mida la dependencia temporal del blanqueo del donador en presencia y ausencia del aceptor flora.Cuatro. Estos resultados pueden utilizarse para calcular la distancia entre los dos restos en la bomba sodio-potasio utilizando el método de forester.

Las mediciones de voltaje en clamping de dos electrodos deben realizarse simultáneamente para asegurar que la proteína sea funcional. Utilizando la función X de clamping en P clamp 10, promedie los resultados de la foto destrucción del fluoróforo donador cuatro durante un mínimo de cuatro grabaciones en sitios oh. Para medir el movimiento relativo de las subunidades proteicas, utilice construcciones de doble cisteína que contengan fluoróforos aceptor y donador cuatro.

La intensidad de fluorescencia en estos residuos es insensible al estado conformacional de la proteína y será una función de la distancia entre los dos grupos. A continuación, cambie el conjunto de filtros en el microscopio a un filtro de excitación 4 75 a F 40, un filtro de emisión 5 95 a F 60 y un espejo dicróico 5 0 5 DRLP. Luego coloque el OI en la cámara sobre la platina del microscopio de fluorescencia.

A continuación, se excita al donador con una fuente de luz de tungsteno de 100 vatios y se mide la intensidad de fluorescencia del aceptor. Se determina Fluoro cuatro mediante un método apropiado, como ligando de voltaje o intercambio de solución, activando la proteína de membrana y midiendo simultáneamente el cambio en la intensidad de fluorescencia. Esta figura muestra la correlación entre el transporte de iones a través de la membrana celular y los cambios en la intensidad de fluorescencia.

El trazo superior muestra mediciones de bloqueo de corriente en presencia de solución de prueba de sodio y solución de prueba de potasio en presencia de 10 micromoles y 10 milimoles de ing. El trazo inferior muestra los cambios en la intensidad de fluorescencia medidos simultáneamente con las mediciones de bloqueo de corriente. Esta figura muestra dos ovocitos marcados con TMRM, el fluoróforo aceptor.

El ovocito de la izquierda expresa la ATPasa de sodio-potasio de tipo silvestre, mientras que el ovocito de la derecha expresa ATPasas de sodio-potasio con un residuo de cisteína accesible. Los trazos superiores de esta figura muestran datos de corriente transitoria tras un pulso de voltaje. Los trazos inferiores muestran grabaciones en tiempo real de los cambios en la intensidad de fluorescencia tras un pulso de voltaje.

Esta figura muestra la dependencia temporal del fotoblanqueamiento: la destrucción fotoquímica del donador se mide en ausencia y presencia del fluoróforo aceptor. El fotoblanqueamiento ocurre más rápidamente en ausencia del fluoróforo aceptor. Cada traza es el promedio de cuatro grabaciones en sitios diferentes. Esta figura muestra el movimiento relativo de las subunidades tras cambios conformacionales.

Los cambios en la fluorescencia se muestran en las trazas rojas y el flujo de corriente se muestra en las trazas negras. Un aumento en la intensidad de fluorescencia mostrado a la izquierda indica que los pisos de flora se acercan. La ausencia de cambio en la intensidad de fluorescencia mostrada en el centro indica que la distancia entre los Fluor cuatro permanece estática.

Una disminución en la intensidad de fluorescencia mostrada a la derecha indica que los Fluor fours se separan más mientras se realiza este procedimiento. Es importante recordar correlacionar los cambios en la intensidad de fluorescencia en estado cinético y en estado estacionario con los cambios conformacionales en la proteína.