Los microchips de silicio para la Manipulación de la interacción célula-célula

Hola, soy Elliot Hu. Soy becario postdoctoral en el laboratorio de Tia aquí en el Instituto Tecnológico de Massachusetts. Hoy vamos a preparar cultivos celulares en microchips mecánicos de silicio. Los dispositivos parecen pequeños peines que se unen entre sí y nos permiten manipular con precisión las interacciones entre dos poblaciones diferentes de células.

Hoy vamos a estudiar la interacción entre los hepatocitos hepáticos y las células estromales de soporte. En concreto, en la superficie superior de los panales se cultivan células de tres fibroblastos, de modo que al desplazar los dedos del peine, se pueden mover las células y cambiar su disposición espacial. Cada dispositivo se divide en dos partes que se unen en dos configuraciones posibles.

El primero pone en contacto las dos poblaciones celulares entre sí. El segundo separa ligeramente las dos poblaciones para que las células no puedan tocarse. Aquí, se evitan las interacciones de contacto, pero se conservan las interacciones a través de factores secretados.

Empecemos hablando de cómo manipular las piezas con pinzas. Me gusta usar pinzas de teflón más grandes y pinzas de metal de punta redonda más pequeñas. Con las pinzas más grandes, puedes recoger las partes de los bordes así con las partes más grandes con los brazos, tienes que tener cuidado de no romper los brazos porque son muy frágiles.

Así que quieres recogerlos en la parte posterior de la pieza de esta manera. Con las pinzas de metal, puede meter la mano en el agujero y recoger las virutas directamente. Las partes más grandes caben en la pared de una placa de 12 pocillos, mientras que las partes más pequeñas caben en una placa de 24 pocillos o se pueden emparejar con la parte más grande.

En una placa de 12 pocillos, generalmente uso la pinza de metal. Cuando manipulo las piezas de las placas para unir dos piezas, normalmente pongo primero la parte más grande en el pozo y la empujo hacia un lado. Luego tomo la reparación complementaria y la pongo al otro lado del pozo, y las junté tomando dos pinzas, una en cada agujero.

Así que ahora puedo bloquear las piezas juntas, ya sea en la configuración de espacio o en la configuración de contacto. Si quiero separar las piezas, me gusta tirar de las piezas hasta la configuración de espacio y luego tirar hacia arriba verticalmente para quitar la pieza. Ahora los dispositivos están hechos de silicona, por lo que deben recubrirse para permitir la adhesión adecuada de las células.

Es probable que reciba los dispositivos ya recubiertos con poliestireno y plasma tratados, por lo que supondremos que ese es nuestro punto de partida. En primer lugar, vamos a utilizar el colágeno para recubrir la superficie a la que se adherirán los hepatocitos. Vamos a poner los panales de hepatocitos en una solución de 50 microgramos por molino de colágeno, y vamos a incubar a 37 C durante 45 minutos.

Los peines de fibroblastos, por otro lado, no necesitamos recubrir. Después de la incubación, aspiramos la solución de colágeno y lavamos y regamos. Ahora vamos a bloquear los ES juntos en contacto con partes complementarias para que formemos una superficie plana para la siembra de células.

Primero, llenaremos algunos pozos con etanol al 70%. Pondré un par en cada pozo y luego los bloquearé juntos. Después de unirlas, queremos observar las piezas bajo el microscopio para asegurarnos de que sean coplanares.

De vez en cuando, las piezas pueden bloquearse entre sí y desalinearse. Y en el microscopio verás que están en dos planos focales diferentes. En este caso, simplemente separe las piezas y vuelva a juntarlas Después de verificar que la alineación esté bien, dejamos que las piezas se asienten en etanol durante un tiempo para esterilizar.

A menudo tengo prisa, así que me repojo durante 10 minutos. Después de la esterilización, debemos enjuagar. El etanol aspira y lava completamente en agua, luego aspira y lava en agua nuevamente, y finalmente aspira el agua y reemplaza con tus medios de cultivo.

Ahora vamos a sembrar células en los dispositivos. Por lo general, suspendemos las células a una concentración de 500.000 células por mililitro, y pipeteamos una suspensión de mililitros sobre cada par de panales utilizando una placa de 12 pocillos. Así que sembramos los fibroblastos a 500.000 células por mililitro en dos de los pocillos.

Del mismo modo, tomamos una suspensión de 500.000 hepatocitos por pocillo y los sembramos en los otros dos pozos. Ahora, antes de incubar, vamos a agitar bien las células para asegurarnos de que se distribuyen uniformemente. Y me gusta agitar tres veces verticalmente, tres veces horizontalmente, y luego repetir esto tres veces.

Después de agitarlo, lo colocaremos en la incubadora y dejaremos reposar las células durante 15 minutos, momento en el que las volveremos a agitar. Después de agitar cada 15 minutos durante una hora, vamos a aspirar la suspensión de celdas y jugar en una nueva suspensión de celdas. Y vamos a repetir esto hasta que tengamos una capa confluente de células.

Por lo general, con los fibroblastos, se necesitan uno o dos asientos. Y en el caso de los hepatocitos, puede tomar de dos a cuatro asientos. Para obtener una monocapa confluente, las células se asientan a una densidad bastante alta, agitándose, asegura que las células se distribuyan uniformemente.

Después del primer asiento, se forma una capa dispersa de células. Tenga en cuenta que las células solo se adhieren a los dedos que han sido recubiertos con poliestireno y colágeno. Después de sembrar células frescas e incubar durante otra hora, nuevamente agitando cada 15 minutos, la capa celular se vuelve más densa.

Después de la tercera siembra, tenemos una buena densidad de celdas, y ahora podemos detenernos después de que las celdas se hayan sembrado en los panales. Queremos manipular las células en la configuración experimental deseada. Los dispositivos ahora se separan de sus partes complementarias y se incuban durante 24 horas.

Después de 24 horas, las células se han extendido para formar una monocapa confluente sobre la superficie de los panales. Ahora queremos formar una co-cultura. El peine de hepatocitos y el peine de fibroblastos ahora se transfieren al mismo pocillo y se bloquean juntos en la configuración inicial deseada.

Si lo desea. Después de un cierto período de tiempo, puede cambiar la configuración. Por ejemplo, podemos pasar a la configuración de espacio después de 18 horas, las piezas se colocan en la misma, se juntan bien hasta que se alcanza la configuración de espacio y luego se empujan en contacto nuevamente en la configuración de espacio.

Y ahora vamos a quitar un peine. Lo que vamos a hacer ahora es pasar por el proceso de quitar la capa vieja de poliestireno, limpiar las virutas y luego colocar una nueva capa de poliestireno y prepararla para el cultivo celular. Una vez más, al quitar la antigua capa de poliestireno y poner una capa nueva, nos aseguramos de que nada de la historia del experimento anterior interfiera con un nuevo experimento.

Entonces, una vez que hayas terminado con tu experimento, lo primero que debes hacer es blanquear tus células y luego enjuagar tus peines y agua. Entonces, antes de poner las papas fritas en la punta, debes asegurarte de que estén completamente secas. Así que aquí tenemos unos cuantos peines que acabo de dejar secar un rato al aire y comprobar que está completamente seco.

Y ahora vamos a tomar un poco de dedo del pie y ponerlo en este altavoz de vidrio. Vamos a usar una pipeta de vidrio aquí para que no lo disuelvan. Halloween disuelve el plástico, por lo que no podemos usar una pipeta de poliestireno típica.

Está bien, eso es suficiente. Y ahora tomaremos un par de estas partes, las colocaremos en la punta, y voy a encender la coctelera para agitar y la cubriremos con papel de aluminio para evitar que el tolueno se evapore. Entonces, después de dos horas, el tolueno debería haber disuelto la mayor parte del poliestireno en los peines, y podemos sacarlos y secar al aire los peines.

Después del enjuague de Halloween, las piezas deben estar relativamente libres de poliestireno y deben estar relativamente limpias. Sin embargo, necesitamos que las piezas estén extremadamente limpias para que la nueva capa de poliestireno forme una buena adherencia si no están extremadamente limpias. La poli tidad tiende a despegarse en medio del experimento, cuando las células comienzan a tirar de ella.

Así que lo que vamos a hacer ahora es una limpieza con ácido de piraña. He puesto las piezas en un altavoz de cristal y vamos a calentarlo. Así que vamos a poner un plato caliente.

Y aquí tenemos el ácido sulfúrico y el peróxido de hidrógeno. Primero voy a verter el ácido sulfúrico, y aquí, me aseguro de que todas las virutas estén sumergidas debajo del líquido. A veces tienen tendencia a flotar.

Y también ahora que estamos trabajando con productos químicos bastante corrosivos, asegúrate de llevar el equipo de protección adecuado. Aquí. Llevo guantes de nitrilo. Ahora vamos a verter el peróxido de hidrógeno en el ácido y vamos a tener cuidado aquí porque es una reacción exotérmica.

Así que puedes ver que está humeando un poco a medida que reacciona, pero queremos agregar algo de energía al sistema para hacerlo aún más reactivo. Así que ahora vamos a calentarlo hasta 120 grados centígrados aproximadamente a la una y 20, por lo que pueden estar seguros de que cualquier resto de su cultivo celular se limpiará completamente de sus chips. Entonces, en este punto, desea dejar que la reacción siga su curso completo hasta que se consuma todo el peróxido de hidrógeno.

Y en ese punto, la mezcla va a dejar de burbujear. Por lo tanto, la reacción tarda aproximadamente media hora en seguir su curso. Y después de que deje de ver las burbujas, puede apagar la placa caliente y dejar que se enfríe.

Y vamos a transferirlos a un agua curva BAK. Y una vez más, asegúrese de que está usando pinzas de teflón aquí, no de metal, y puede simplemente recogerlas y transferirlas. Así que ahora solo vamos a enjuagarlo bajo un flujo constante de DDH dos O., por lo general lo tomo directamente del Meine y lo dejaremos funcionando durante al menos 10 minutos aquí.

Y al hacerlo, vamos a lavar todos los restos de ácido después de picar bajo un chorro de agua durante 10 minutos. El ácido debe ser removido de las virutas, y vamos a almacenarlas bajo el agua hasta el momento en que estemos listos para recubrir el poliestireno de 45.000 pesos moleculares que obtuvimos de Sigma. Y vamos a pesar una pequeña cantidad de eso aquí.

Tenemos 400 miligramos y lo vamos a disolver en tolueno a 100 miligramos por mililitro. Por lo tanto, el tolueno debe manipularse en el capó. Y la otra cosa es que, dado que vamos a usar un tolueno para disolver el poliestireno, queremos asegurarnos de que no usamos ropa de laboratorio que esté hecha de poliestireno.

Así que aquí estamos usando polipropileno, cónico y una pipeta de vidrio. Así que como tengo 400 miligramos de poliestireno, voy a poner cuatro mililitros de dedo, y ahora vamos a vórtice durante media hora hasta que el poliestireno se disuelva. Así que ahora vamos a vórtice el tubo a la velocidad más baja durante unos 20 minutos a media hora.

Así que voy a conectar el tubo a los vórtices. No tengo que mantenerlo allí todo el tiempo. Después de 20 a 30 minutos, el poliestireno debe disolverse y estamos listos para recubrirlo.

Ahora vamos a aplicar una capa giratoria del poliestireno en nuestras instalaciones. Nuestro codificador de espín se encuentra en una instalación de sala limpia. Y así, aquí tenemos que usar una gorra, gafas, una bata, botines y guantes, pero eso puede no ser lo mismo en sus instalaciones.

Antes de usar este mandril, quiero protegerlo del poliestireno. Así que vamos a cubrirlo con papel de aluminio, y queremos que quede lo más plano posible con respecto a la superficie para que el chip pueda quedar al ras de la superficie. Vamos a hacer un pequeño agujero justo en el centro para que podamos mantener el vacío en el chip.

El codificador de giro está configurado a 2, 400 RPM y 30 segundos. Ahora podemos tomar una de nuestras fichas, colocarla de manera que el centro de la ficha cubra el agujero, y voy a tener la aspiradora apagada al principio cuando coloque el poliestireno, encienda la aspiradora y luego comience a centrifugar. Entonces, para las partes más pequeñas, podemos poner menos de 10 gotas.

Y para las partes más grandes, se necesitan un poco más de 10 gotas de poliestireno. Y vamos a girarlo durante 30 segundos a 2.400 RPM. Ahora vamos a tomar las virutas recubiertas de poliestireno y ponerlas en el horno a 120 grados C. Eso es por encima del punto de transición vítreo del poliestireno.

Así que va a refluir la superficie para suavizarla un poco, y también va a densificar y endurecer el plástico. Así que normalmente lo dejo en el horno toda la noche. Probablemente el proceso tarde al menos unas horas en completarse.

Entonces, después de un horneado durante la noche, los chips están listos para el tratamiento con plasma. Ahora vamos a exponer el poliestireno a un plasma de oxígeno, y eso va a cambiar la energía de la superficie para que las proteínas y las células se adhieran mejor a él. Así que vamos a cargar los chips en la cámara de plasma y bombearlos hasta el vacío.

Un buen ajuste para usar es 200 mil, recorrido de vacío y 200 vatios de potencia durante un minuto bajo un flujo de gas oxígeno. Ahora que el sistema está bombeado hacia abajo, vamos a introducir el oxígeno. Bien, ahora podemos encender la alimentación de RF, golpear el plasma durante un minuto.

Entonces, cuando el plasma está funcionando, en realidad brilla. Es como una bombilla fluorescente. Después de un minuto de exposición al plasma, vamos a devolver la presión a la atmósfera y podemos sacar las piezas.

Ahora las piezas están listas para el recubrimiento de proteínas y la alimentación celular. El objetivo al diseñar este dispositivo era que pudiéramos manipular la microarquitectura del tejido de una manera dinámica. Por lo tanto, la microorganización del tejido en el cuerpo, específicamente dónde se colocan las células entre sí, es muy importante para determinar la función de cada célula en particular en el cultivo de laboratorio.

Hasta hace poco, no hemos sido capaces de hacer un buen trabajo en la replicación de eso, pero en los últimos cinco o 10 años, las personas han comenzado a ser capaces de micro modelar células en un sustrato de cultivo de tejidos, colocando así las células exactamente donde queremos tenerlas en una placa de cultivo de tejidos. Y al hacerlo, han podido descubrir algunos aspectos importantes de la biología básica de las interacciones entre células y células a escala micro. Ahora, lo que no hemos podido hacer hasta este momento es hacerlo de manera dinámica.

Es decir, cambiar la organización de un cultivo celular en medio del experimento. Y eso es importante porque en el cuerpo, el tejido no es en realidad un entorno estático. Tenemos células que se mueven y se reorganizan, particularmente en la cicatrización o el desarrollo de heridas.

Pero incluso en un órgano normal en homeostasis, hay muchas cosas moviéndose. El aspecto técnico más difícil de aprender es cómo comer físicamente las piezas. Y al principio, cuando empiezas a trabajar con el sistema, es posible que te sientas intimidado por lo frágiles que son las piezas o lo pequeñas que son las emociones que necesitas crear.

Pero creo que si practicas con él por un tiempo, no deberías tener demasiados problemas. Algunos de los lugares donde vemos que este dispositivo tiene un papel, por ejemplo, en el desarrollo embrionario, las células entrarán en contacto con una serie de entornos celulares diferentes a medida que las células están brotando a través de varias capas embrionarias. Y se sabe que las interacciones con cada una de las capas a medida que entran en contacto secuencialmente, nos empujan a todos más allá en un camino de diferenciación específico.

Y por eso pensamos que este tipo de dispositivo podría ser bueno para tratar de replicar ese tipo de evento en el laboratorio. Uno de los aspectos de la microorganización que queríamos observar particularmente era una diferencia entre las células que se comunican a través de interacciones de contacto donde las membranas celulares pueden tocarse entre sí, frente a los factores solubles que se secretan en los medios circundantes que se difunden a una célula que está un poco más lejos. Y muchas veces, cuando las células están en cocultivo y tienen un efecto entre sí, no ha quedado claro si se trata de interacciones de contacto o de factores secretados que están desempeñando el papel.