Name: El diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o Coexistencia Química / eléctrica / Shear Stress Los estímulos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a diseñar dispositivos microfluídicos con polimetilmetacrilato para estudiar respuestas celulares ante estímulos químicos, eléctricos y de cizallamiento. Esta técnica permite simular condiciones in vivo con precisión.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán bajo el Contrato No. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), y el Proyecto de Desarrollo Profesional de la Universidad Nacional de Taiwán (103R7888) (K. Y. Lo). Los autores también agradecen al Centro de Material Emergente y Dispositivos Avanzados de la Universidad Nacional de Taiwán por el uso de la sala de cultivo celular.

1. Chip de diseño y fabricación <ol><li> Dibujar patrones para ser extirpadas en sustratos de PMMA y cintas de doble cara utilizando software comercial 24. <ol><li> Para estudiar los efectos de las concentraciones químicas y esfuerzos de corte, dibujar un patrón de &quot;árbol de Navidad&quot; con una anchura variable en su extremo en cada una de las cinco áreas de cultivo (Figura 1A y 1B). </li><li> Para estudiar los efectos de las concentraciones químicas y los campos eléctricos, dibujar un patrón de &quot;árbol de Navidad&quot;, con dos canales de fluidos más para puentes de sal (Figura 2A y 2B). </li></ol></li><li> Escriba un patrón individual en una hoja de PMMA o una cinta de doble cara cargando el archivo correspondiente a la punta de trazar láser de CO2. <ol><li> Encender la punta de trazar láser, y comprobar su conexión al ordenador. Abra el patrón que se realiza la ablación usando el software comercial. </li><li> Coloque una hoja de PMMA o una cinta de doble cara on superior de la etapa de la punta de trazar. Ajuste el enfoque del láser de CO 2 si es necesario con la barra de calibración y lo visible láser de He-Ne. </li><li> Cargar el patrón en la punta de trazar para la ablación en la hoja de PMMA o la cinta. </li><li> Recoge la lámina o cinta con dibujos, eliminar las piezas no deseados, y limpie la superficie con inyección de nitrógeno. NOTA: El espesor de la hoja de PMMA es 1 mm, y la de la cinta de doble cara es 0,07 mm o 0,22 mm. </li></ol></li></ol> 2. Asamblea de la viruta <ol><li> Con pegamento, coloque adaptadores en acrílico (largo x ancho x altura = 10 mm x 10 mm x 5 mm, con roscas de tornillo en el centro) a la en la capa superior del chip mediante la alineación de las roscas de los tornillos y los agujeros en la parte superior -la mayoría capa. Estos adaptadores sirven como entradas / salidas y conectores puente salino medio. </li><li> Montar el chip de microfluidos dentro de una campana de flujo laminar. </li><li> Montar el chip de microfluidos estrés químico cizalla (chip CSS). <ol><li> UNttach 3 hojas de hojas de PMMA trazadas utilizando 2 piezas de trazada cinta de doble cara. (Figura 1A y 1B). </li><li> Añadir una pieza más del 0,07 mm de espesor cinta de doble cara a la parte inferior del chip y adjuntar el chip a un diámetro del plato 10 cm Petri. </li><li> Poner el chip de montaje en la cámara de vacío durante toda la noche. </li></ol></li><li> Para montar el chip campo químico-eléctrica (chip CEF), adjuntar la hoja de PMMA en una cinta de doble cara de espesor = 0,22 mm (Figura 2A y 2B). <ol><li> Adjuntar la hoja de PMMA descrito y la cinta de doble cara en una placa de 10 cm de diámetro Petri utilizando este mismo trozo de cinta. </li></ol></li><li> Deje el chip montado dentro de la campana y exponerlo a los rayos UV durante 30 minutos para la esterilización. </li><li> Conectar las entradas a dos jeringas de 3 ml a través de tubos de plástico y tuercas apretadas a mano. Conectar la salida a un tubo de residuos a través de un tubo de plástico y una tuerca con los dedos. NOTA: Autoclavetodos los tubos y tuercas a 121 ° C durante 15 min antes de su uso. </li><li> Presione lentamente el émbolo de la jeringa para primos los canales de fluidos con PBS. Empuje jeringas de ida y vuelta para eliminar las burbujas. </li><li> Poner las patatas fritas en el interior de una incubadora durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. NOTA: Estos dos pasos se dirigen a lavar el chip y eliminar las burbujas que quedan dentro del chip. </li><li> Tome el chip de la incubadora. </li><li> Preparar puentes de sal de agar para generar campos eléctricos en el chip CEF. <ol><li> Disolver 3% de agarosa de bajo punto de fusión en tampón 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando un horno de microondas. </li><li> Inyectar la solución de fase de agarosa en el canal de puente salino e insertar los electrodos antes de solución solidifica. </li><li> Colocar electrodos / plata-cloruro de plata en las tuercas tubulares. </li></ol></li><li> Conectar las jeringas a las bombas de jeringa, y de forma continua el flujo del medio de cultivo (Modificado de Dulbecco Eagler17; s medio, DMEM) en el canal fluídico durante 10 min a un caudal de 20 l / min para reemplazar PBS. </li></ol> 3. Preparación de células y configuración experimental NOTA: Pre-caliente 1x PBS, medio de cultivo (DMEM más FBS), y tripsina en un baño de agua C 37 ° antes de su uso. <ol><li> Plate 2 x 10 con cáncer de pulmón de células 5 CL1-5 25,26 en un plato de 10 cm Petri suministrado con DMEM más suero bovino fetal al 10% (FBS). Se incuban las células dentro de un incubador bajo 5% de CO2 a 37 ° C hasta 90% de confluencia. </li><li> Aspirar el medio y se lavan las células una vez con pre-calentado PBS 1x. Añadir 2 ml de tampón de tripsina 0,05% a las células y esperar a 2-3 min a 37 ° C para separar las células. </li><li> Transferir las células a un tubo de centrifugación estéril de 15 ml y añadir 6 ml de medio de cultivo en el tubo. Invertir suavemente el tubo para mezclar y llevar a cabo 5 l de medio que contiene células para contar el número de células en un hemocytometer. </li><li> Se centrifuga el tubo a 300 x g durante 5 min. Suspender 10 6 células en 1 ml de medio de cultivo y colocar el medio que contiene células en una jeringa de 1 ml. </li><li> Infundir el medio que contiene células en el chip de microfluidos de la toma y asegúrese de que la solución distribuye a lo largo de las cinco áreas de cultivo. Incubar el chip dentro de un incubador bajo 5% de CO2 a 37 ° C durante 2 hr. </li></ol> 4. Configuración Experimental <ol><li> Tome el chip de la incubadora y colocarlo en la parte superior de un calentador de vidrio de óxido de indio y estaño transparente (ITO). NOTA: El vidrio ITO está conectado a un controlador proporcional-integral-derivativo (PID) para mantener la temperatura a 37 ± 0,5 ° C a través de la retroalimentación de un acoplador térmico sujeta firmemente entre el calentador de ITO y el chip. </li><li> Coloque el conjunto de chips-calentador en la parte superior de una etapa XY motorizado de un microscopio invertido para el seguimiento de la migración de células o una etapa fija XY deun microscopio de fluorescencia invertida para la medición de la producción de ROS. </li><li> Para generar diferentes concentraciones químicas, llenar dos jeringas con 5 ml de soluciones químicas de concentraciones relativas 0 y 1 (disuelto en medio de cultivo) y la bomba de ellos en el chip a velocidades de flujo deseadas: en el chip CSS, a un caudal de 0,3 ml / min durante 1 hora; en el chip CEF, con un caudal de 20 l / min para el primero 20 min y un caudal de 20 l / hr para otro 120 min (tiempo total = 2 h). </li><li> En el chip CEF, para el seguimiento de la migración celular, programa de la etapa de XY del microscopio para repetir tomar fotos, a través de un solo lente reflex digital (DSLR), de ciertos campos de visión (FOV) dentro de las áreas de cultivo cada 15 minutos durante 2 hora </li><li> Para la medición de la producción de ROS, utilizar el indicador basado en la fluorescencia de 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluoresce diacetato de (2 &#39;-7&#39;-DCFDA). <ol><li> Preparar la acción de 2&#39;-7&#39;-DCFDA a 10 mM en di calidad para biología molecularsulfóxido de metilo (DMSO). Diluir DCFDA en DMEM sólo sin suero (5 mM en DMEM). El deacetilasa potencial podría aumentar las señales de fondo y disminuir las señales en las células. </li><li> Después de 1 hr de estímulo tensión de corte en el chip CSS o después de 2 h de EF estímulo en el chip CEF, la bomba de 2&#39;-7&#39;-DCFDA (5 mM en DMEM) en el chip a un caudal de 20 l / min para la primera 20 min y un caudal de 20 l / hr durante otros 20 min. Para el lavado, la bomba de DMEM en el chip a un caudal de 20 l / h durante 20 min. </li><li> Tomar fotos, a través de una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD), de ciertos FOV dentro de las áreas de cultivo para el análisis de las intensidades fluorescentes. </li></ol></li></ol> 5. Los cálculos de las concentraciones químicas, esfuerzos de corte, y los campos eléctricos <ol><li> En tanto el chip y el chip CSS CEF, el cálculo de las concentraciones químicas en las cinco áreas de cultivo. Por ejemplo, mediante la inyección de H 2 O 2 de concentrciones 0 y 200 micras de las dos entradas, las concentraciones de 0, 25, se generan 100, 175 y 200 micras. NOTA: Si se asume que todos los líquidos se separaron de flujo suave y uniformemente sobre el tenedor, las concentraciones relativas de las cinco áreas de cultivo son 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1, respectivamente. </li><li> En el chip de CSS, calcular la tensión de corte (τ) dentro de cada una de las áreas de cultivo utilizando <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" /> 27, donde Q es el caudal volumétrico, η es la viscosidad de fluidos, h es la altura del canal, y W es la anchura del canal. NOTA: Al establecer Q = 0,3 ml / min en cada entrada (Q = 0,12 ml / min en cada área de cultivo), η = 0,0008 Pa · s para el medio de cultivo, h = 1 mm, y w = 1 ~ 4 mm, la tensión de cizallamiento se calcula en un rango de 0,0048 Pa (4 mm región de ancho) a 0,0192 Pa (1 mm región de ancho). </li><li> Enel chip CEF, calcular la fuerza de FC dentro de cada una de las áreas de cultivo utilizando E = E / (s A ef) (ley de Ohm), donde I es la corriente eléctrica que fluye a través del canal de fluido, σ es la conductividad eléctrica del medio de cultivo, y A eff es el área de sección transversal efectiva del canal. NOTA: El uso σ = 1,38 Ω -1 m -1 para medio de cultivo y A eff = 0,22 mm 2 (anchura = 1 mm y la altura = 0,22 mm), la resistencia EF se calcula para ser E (mV / mm) = I ( A) × 3,3 × 10 6. <ol><li> Como se muestra en la Figura 2D, tratar el circuito equivalente cinco circuitos de sección C con cuatro (8 + 35 + 8) segmentos y uno (5 + 35 + 5) segmento. NOTA: Al analizar este circuito paralelo de acuerdo con la ley de voltaje de Kirchhoff y la ley de Ohm, las corrientes que fluyen a través de la cultura son cincocomo, I 1 a I 5 de abajo hacia arriba, se calculan en alrededor de 0,49 I (zona 1), 0,25 I (zona 2), 0,13 I (zona 3), 0,08 I (zona 4), ​​y 0,05 I (área de 5), respectivamente, donde I es el total de corriente continua (cC). Con una corriente continua aplicada de 0.157 mA, los EF de 254, 130, 67, 41, y 26 mV / mm se generan dentro de las cinco áreas de cultivo. NOTA: Para un análisis eléctrico simplificado de la red de microfluidos, todos los segmentos de fluidos se consideran como resistencias con resistencia proporcional a su longitud. </li></ol></li></ol> Análisis 6. Datos Nota: El análisis de datos se realizó utilizando el software ImageJ. <ol><li> Analizar la producción de ROS. <ol><li> Ejecutar el software ImageJ. Ir a &quot;Archivo&quot; → Abrir para cargar una imagen fluorescente para ser analizada. </li><li> Ir a &quot;Imagen&quot; → &quot;Tipo&quot; → &quot;16-bit&quot; para cambiar el imedad a una escala de grises. </li><li> Dibujar un polígono para encerrar una célula. Ir a &quot;Analizar&quot; → &quot;medida&quot; para medir la intensidad media de fluorescencia de la célula. </li><li> Repita 6.1.3 para recoger intensidades de al menos 50 células de tres experimentos independientes, y calcular la intensidad media con el error estándar de la media (SEM). </li><li> Repita 6.1.1-6.1.4 para cada condición experimental. </li></ol></li><li> Analizar la migración celular. <ol><li> Ejecutar el software ImageJ. Ir a &quot;Archivo&quot; → Abrir para cargar una imagen tomada en el tiempo = 0 a analizar. </li><li> Dibujar un polígono para encerrar una célula. Ir a &quot;Analizar&quot; → &quot;medida&quot; para medir el centro de masa de la célula como (x 1, y 1). </li><li> Repetir 6.2.1- 6.2.2 para medir el centro de masa de la misma célula que (x 2, y 2) a partir de otra imagen tomar en el tiempo = t. </li><li> Calcular la tasa de migración (en m / h) deesta célula como <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" /> . </li><li> Repita 6.2.1-6.2.4 para recoger las tasas de migración a partir de al menos 50 células de tres experimentos independientes, y calcular la tasa media de migración con el error estándar de la media (SEM). </li><li> A partir de 6.2.2 y 6.2.3, se calcula la direccionalidad de migración de esta célula como θ o coseno <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" /> , Donde θ es el ángulo entre el vector de la EF aplicada (de positivo a negativo) y el vector desde el inicio a la posición final de la célula (Figura 2G). </li><li> Repita 6.2.6 para recoger directedness la migración a partir de al menos 50 células de tres experimentos independientes, y calcular la migración direccionalidad media con el error estándar de la media (SEM). </li><li> Calcular la tasa de migración media con SEM y la direccionalidad de migración media con SEM para cada condición experimental. NOTA: Una direccionalidadde 1 indica que todas las células migran hacia el cátodo, y un valor de -1 indica que todas las células migran hacia el ánodo. La direccionalidad de un grupo de células que se mueven al azar es cercano a 0. </li></ol></li><li> Analizar Alineación de la celda. <ol><li> Ejecutar el software ImageJ. Ir a &quot;Archivo&quot; → &quot;Abrir&quot; para cargar una imagen para ser analizada. </li><li> El tratamiento de la célula como una elipse y trazar una línea para indicar el eje mayor de una célula. Ir a &quot;Analizar&quot; → &quot;medida&quot; para medir el ángulo β entre la línea y la dirección EF horizontal. </li><li> Repita 6.3.2 para recoger β de por lo menos 50 células de tres experimentos independientes, y calcular media coseno β con el error estándar de la media (SEM). </li><li> Repita 6.3.1-6.3.3 para cada condición experimental. NOTA: A cos β de 1 indica que todas las células se alinean en paralelo a la EF aplicada, y un valor de 0 indica que todas las células se alinean perpendicularlY a la EF aplicada. </li></ol></li></ol>

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<li>Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulent+fluid+shear+stress+induces+vascular+endothelial+cell+turnover+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).</li>
<li>Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+process+stress+on+suspended+anchorage-dependent+mammalian+cells+as+an+indicator+of+likely+challenges+for+regenerative+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines.</a> Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).</li>
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<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

los chips basados ​​en PMMA se confeccionan mediante ablación con láser y la escritura que son los métodos más fáciles y más baratos en comparación con los chips basados ​​en PDMS que requieren más complicado litografía blanda. Después de diseñar un chip de microfluidos, la fabricación y el montaje se puede hacer en tan sólo 5 min. Hay algunos pasos críticos que se deberá prestar atención a en la realización del experimento. La primera es la cuestión &quot;montaje&quot;. Los adaptadores deben pegarse correctamente al en...

En las células in vivo están rodeados por una variedad de biomoléculas, incluyendo la matriz extracelular (ECM), hidratos de carbono, lípidos, y otras células. Ellos funcionalizar respondiendo a los estímulos micro-ambientales tales como interacciones con ECM y las respuestas a los gradientes químicos de diferentes factores de crecimiento. Tradicionalmente, los estudios de células in vitro se llevan a cabo en placas de cultivo celular en el que el consumo de las células y los reactivos es grande y las células crecen en una estática (no circulante) medio ambiente. Recientemente, los dispositivos de micro-fabricada integrados con componentes fluídicos han proporcionado una plataforma alternativa para los estudios de células de una manera más controlable. Tales dispositivos son capaces de crear un micro-entorno precisa de los estímulos químicos y físicos y reducir al mínimo el consumo de las células y los reactivos. Estos chips de microfluidos pueden estar hechos de sustratos de vidrio, obleas de silicio, polidimetilsiloxano polímeros (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA) sustratos, o polyethylenetereftalato (PET) Sustratos 1-3. dispositivos basados ​​en PDMS son transparentes, biocompatible, y permeable a los gases, haciéndolos adecuados para el cultivo celular a largo plazo y estudios. PMMA y PET sustratos son baratos y fáciles de ser procesados ​​utilizando ablación por láser y la escritura. Los dispositivos microfluídicos deben proporcionar células con un micro-entorno estable y controlable donde las células están sujetos a diferentes estímulos químicos y físicos. Por ejemplo, chips de microfluidos se utilizan para estudiar la quimiotaxis de las células. En lugar de los métodos tradicionales que emplean cámara de Boyden y capilar 4,5 estos dispositivos fluídicos miniaturizados pueden generar gradientes químicos precisos para el estudio de los comportamientos células &#39;1,6,7. Otro ejemplo es el estudio de la migración direccional de células bajo campos eléctricos (EFS), fenómeno llamado electrotaxis. Se informó de comportamientos Electrotactic de células que estar relacionado con la regeneración del nervio 8, el desarrollo embrionario 9,y la cicatrización de la herida 10,11. Además, muchos estudios se han realizado para investigar la electrotaxis de diversos tipos de células incluyendo células de cáncer de 12,13, linfocitos 14,15, células de leucemia 11, y las células 16 madre. Convencionalmente, placas de Petri y cubiertas de vidrio se utilizan para construir cámaras electrotactic para la generación de los EF 17. Tales configuraciones simples plantean problemas de evaporación media y EFS imprecisas, pero pueden ser superados por los dispositivos de microfluidos de canales de fluidos cerrado, bien definidos 12,18,19. Para estudiar sistemáticamente respuestas celulares en virtud de estímulos químicos y eléctricos precisos y controlables, sería de gran utilidad para el desarrollo de dispositivos de microfluidos capaces de proporcionar células con estímulos múltiples al mismo tiempo. Por ejemplo, Li et al. informó de un dispositivo de microfluidos basada en PDMS para la creación de una o coexistiendo gradientes químicos y los EF 20. Kao et al. devfugado un chip de microfluidos similar a modular la quimiotaxis de las células de cáncer de pulmón por EFS 6. Por otra parte, para aumentar el rendimiento, Hou et al. diseñado y fabricado un chip de doble-eléctrico-campo multicanal basados ​​en PMMA para proporcionar células con 8 diferentes estímulos combinados, (2 puntos fuertes concentraciones de EF x 4 químicos) con 21. Para aumentar aún más el largo de y añadir el estímulo tensión de cizallamiento, hemos desarrollado dos dispositivos de microfluidos a base de PMMA para el estudio de las respuestas celulares en virtud de estímulos de estrés químicas simple o coexistiendo / eléctricos / cizallamiento. Informado por Lo et al. 22,23, estos dispositivos contienen cinco canales de cultivo de células independientes que están sujetos a una circulación continua de fluidos, que imitan el sistema circulatorio in vivo. En el primer chip (chip química cizalla estrés o el chip CSS), cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 se generan en las regiones de cultivo, y un gradiente de tensión de cizallamiento es produced dentro de cada una de las cinco áreas de cultivo. En el segundo chip (chip-químico de campo eléctrico o el chip CEF), mediante el uso de un único conjunto de electrodos y 2 bombas de jeringa, cinco puntos fuertes EF se generan, además de cinco concentraciones químicas diferentes dentro de estas áreas de cultivo. cálculos y simulaciones numéricas se realizan para un mejor diseño y operan estos chips, y las células de cáncer de pulmón cultivadas dentro de estos dispositivos están sujetos a los estímulos individuales o coexistentes para la observación de las respuestas con respecto a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la tasa de migración, y la dirección de migración. Estos chips se demostraron ser, de alto rendimiento y fiables en la investigación de cómo las células responden a diversos estímulos ambientales micro-ahorro de tiempo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092 Medio de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>separar la célula de la placa</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>10 cm Cultivo celular Placa de Petri</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Bright-Line&nbsp; Hemacitómetro</td><td>Sigma Z359629</td><td></td><td>Equipo de conteo de células</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>Personalizado</td><td>Adaptador</td> de <td>chip microfluídico</td>personalizado</tr><tr><td></td><td>Personalizado Chip</td><td>microfluídico</td><td>personalizado</td></tr><tr><td>0.07 / 0.22 mm cinta de doble cara&nbsp;</td><td>3M</td><td>8018/9088</td><td>Chip microfluídico</td></tr><tr><td>Bajo punto de fusión agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>Puente salino</td></tr><tr><td>2'-7'-diclorodihidrofluorescente diacetato</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>Medición de ROS intracelular</td></tr><tr><td>Vidrio de óxido de indio y estaño (ITO)</td><td>Calentador</td><td>300739</td><td>Merck</td></tr><tr><td>Controlador proporcional-integral-derivado&nbsp;</td><td>JETEC Electrónica Co.</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Controlador de temperatura</td></tr><tr><td>Acoplador térmico</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A Controlador de</td><td>temperatura</td></tr><tr><td>CO2 trazador láser</td><td>Laser Tools & Técnicas Corp.</td><td>ILS2</td><td>Fabricación de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>Bombas de jeringa</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td>Bombeo de medios y productos químicos en el chip</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Ciencia Mayor&nbsp;</td><td>MP-300V</td><td>Suministro de corriente continua</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Monitoreo de la migración celular</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente invertido</td><td>Nikon</td><td>TS-100 Monitoreo de</td><td>señales fluorescentes y migartion celulares</td></tr><tr><td>Cámara DSLR</td><td>Canon</td><td>60D</td><td>Grabación de imágenes de campo claro&nbsp;</td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi1 Grabación de</td><td>imágenes fluorescentes&nbsp;</td></tr><tr><td>superpegamento</td><td>3M Scotch</td><td>7004</td><td>Fijación de adaptadores a sustratos de PMMA</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Diseño de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Disolución DCFDA</td></tr><tr><td>ImageJ Institutos</td><td>Nacionales de Salud</td><td></td><td>Cuantificación de intensidades fluorescentes y migración celular</td></tr></tbody></table>

el diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o coexistencia química / eléctrica / shear stress los estímulos

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Los dispositivos microfluídicos son capaces de crear un micro-entorno celular precisa y controlable de pH, temperatura, concentración de sal, y otros estímulos físicos o químicos. Se han utilizado comúnmente para estudios de células in vitro, proporcionando in vivo como entorno. Especialmente, la forma de respuesta de las células a los gradientes químicos, campos eléctricos, y esfuerzos de corte ha dibujado muchos intereses ya que estos fenómenos son importantes en la comprensión de las propiedades y funciones celulares. Estos chips de microfluidos pueden estar hechos de sustratos de vidrio, obleas de silicio, polímeros de polidimetilsiloxano (PDMS), polimetilmetacrilato (PMMA), sustratos o sustratos polietilentereftalato (PET). Fuera de estos materiales, los sustratos de PMMA son baratos y se pueden procesar fácilmente usando la ablación por láser y la escritura. Aunque algunos dispositivos microfluídicos se han diseñado y fabricado para generar múltiples, coexistiendo estímulos químicos y eléctricos, se consideró que ninguno de elloslo suficientemente eficiente en la reducción de las repeticiones experimentales, en particular con fines de detección. En este artículo, describimos nuestro diseño y fabricación de dos chips de microfluidos basada en PMMA para la investigación de las respuestas celulares, en la producción de especies reactivas de oxígeno y la migración, bajo estímulos de estrés individuales o coexistentes químicos / eléctricos / pernos de seguridad. El primer chip genera cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 en las regiones de cultivo, junto con un gradiente de tensión de cizalladura producida en el interior de cada uno de estas áreas. El segundo chip genera la misma concentración relativa, pero con cinco intensidades de campo eléctrico creado diferentes dentro de cada área de la cultura. Estos dispositivos no sólo proporcionan células con una, controlable microambiente precisa, pero también aumentan en gran medida el rendimiento experimental.

El estrés químico-cizalla (CSS) de la viruta El chip CSS está hecho de tres hojas de PMMA, cada una de 1 mm de espesor, unidos entre sí por medio de dos cintas de doble cara, cada una de espesor de 0,07 mm (Figura 1A y 1B). La estructura de &quot;árbol de Navidad&quot; genera cinco concentraciones relativas de 0, 1/8, 1/2, 7/8, y 1 en las cinco áreas de cultivo. Mediante el diseño de la zona d...

Los dispositivos microfabricados integrados con componentes fluídicos proporcionan una plataforma in vitro para estudios celulares que imitan el microambiente in vivo. Desarrollamos chips microfluídicos basados en polimetilmetacrilato para estudiar las respuestas celulares bajo estímulos de estrés químico/eléctrico/cizallante únicos o coexistentes.

El diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o Coexistencia Química / eléctrica / Shear Stress Los estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

El objetivo general de este procedimiento es diseñar y fabricar dispositivos microfluídicos para observar cómo las células responden a estímulos ambientales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular e ingeniería biomédica, como por ejemplo cómo responden las células ante diferentes estímulos ambientales, incluyendo productos químicos, esfuerzos cortantes y campos eléctricos. La principal ventaja de esta técnica es que los tubos son fáciles de fabricar y ensamblar. Además, estos dispositivos microfluídicos pueden reproducir condiciones in vivo con capacidades excelentes. Quien demostrará el procedimiento será Tzu-Yuan Chou, una estudiante de pregrado de mi laboratorio, y Hsien-San Hou, un investigador postdoctoral del laboratorio del Dr. Julian Chung. Para comenzar, encienda el grabador láser de dióxido de carbono y verifique su conexión con la computadora. Luego, cargue un patrón previamente dibujado de árbol de Navidad, como uno de los patrones mostrados aquí, en el grabador. A continuación, coloque una lámina de PMMA o un trozo de cinta adhesiva de doble cara sobre la plataforma del grabador. Ajuste el enfoque del láser de dióxido de carbono utilizando la barra de calibración y el láser visible de helio-neón. Después, grabe el patrón sobre el sustrato. Al terminar, tome el sustrato con el patrón, retire las piezas no deseadas y use un chorro de nitrógeno para limpiar la superficie de cualquier residuo restante. Repita este proceso para cada componente del chip. Ensamble el chip microfluídico de esfuerzo cortante químico. Para lograrlo, una tres láminas del patrón de PMMA con diseño de esfuerzo cortante químico utilizando dos piezas de cinta adhesiva de doble cara grabada. Use pegamento cianocrilato para fijar un adaptador de acrílico con rosca en el centro a la capa superior de PMMA del chip, alineando las roscas y los orificios. Estos adaptadores servirán como entradas y salidas de medio y conectores de puente salino. Luego, agregue una pieza adicional de cinta adhesiva de doble cara de 0,7 mm de espesor en la parte inferior del chip y fije el chip a una placa de Petri de 10 cm de diámetro. Una vez ensamblado, coloque el chip en una cámara de vacío durante toda la noche. Ahora ensamble el chip de campo químico-eléctrico. Fije la lámina de PMMA grabada para el chip de campo químico-eléctrico con cinta adhesiva de doble cara a una placa de Petri de 10 cm de diámetro. Antes de usar los chips, expóngalos a UV durante 30 minutos para esterilizarlos. A continuación, conecte las entradas de los chips a jeringas de 3 ml llenas con PBS mediante tubos plásticos y tuercas de rosca manual. De manera similar, conecte las salidas a un tubo de desecho. Presione lentamente el émbolo de la jeringa para cebado de los canales fluidos con PBS. Mueva la jeringa hacia adelante y hacia atrás para eliminar las burbujas, luego coloque los chips dentro de una incubadora durante toda la noche. Para configurar los chips de campo químico-eléctrico, llene las tuercas tubulares con agarosa al 3 % para establecer los puentes salinos. Luego, coloque los electrodos de cloruro de plata en las tuercas tubulares. Cultive células de cáncer de pulmón CL1-5 en D-MEM suplementado con 10 % de FBS hasta que alcancen una confluencia del 90 %. Luego, aspire el medio. Lave las células una vez con PBS previamente calentado. Y agregue 2 ml de una solución tampón de tripsina al 0,5 % a una placa de 10 cm de diámetro. Vuelva a colocar las células en el incubador a 37 °C.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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Aquí presentamos un protocolo para fabricar y operar un sistema microfluídico que expone a las células endoteliales a hiperglucemia oscilatoria sincronizada y a estrés de cizalladura pulsátil. Este enfoque proporciona un modelo in vitro fisiológicamente relevante para estudiar la disfunción endotelial diabética. Este protocolo permite la medición cuantitativa del estrés oxidativo y las respuestas de las células endoteliales.

Un sistema microfluídico para modelar la disfunción endotelial bajo esfuerzo fisiológico combinado de cizalladura pulsátil e hiperglucemia oscilatoria

Aprende a diseñar dispositivos microfluídicos con polimetilmetacrilato para estudiar respuestas celulares ante estímulos químicos, eléctricos y de cizallamiento. Esta técnica permite simular condiciones in vivo con precisión.

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El diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o Coexistencia Química / eléctrica / Shear Stress Los estímulos

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