El diseño de dispositivos de microfluidos para el estudio de las respuestas celulares en la sección individual o Coexistencia Química / eléctrica / Shear Stress Los estímulos
13 de agosto de 2016
Los dispositivos microfabricados integrados con componentes fluídicos proporcionan una plataforma in vitro para estudios celulares que imitan el microambiente in vivo. Desarrollamos chips microfluídicos basados en polimetilmetacrilato para estudiar las respuestas celulares bajo estímulos de estrés químico/eléctrico/cizallante únicos o coexistentes.
El objetivo general de este procedimiento es diseñar y fabricar dispositivos microfluídicos para observar cómo las células responden a estímulos ambientales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular e ingeniería biomédica, como por ejemplo cómo responden las células ante diferentes estímulos ambientales, incluyendo productos químicos, esfuerzos cortantes y campos eléctricos. La principal ventaja de esta técnica es que los tubos son fáciles de fabricar y ensamblar. Además, estos dispositivos microfluídicos pueden reproducir condiciones in vivo con capacidades excelentes. Quien demostrará el procedimiento será Tzu-Yuan Chou, una estudiante de pregrado de mi laboratorio, y Hsien-San Hou, un investigador postdoctoral del laboratorio del Dr. Julian Chung. Para comenzar, encienda el grabador láser de dióxido de carbono y verifique su conexión con la computadora. Luego, cargue un patrón previamente dibujado de árbol de Navidad, como uno de los patrones mostrados aquí, en el grabador. A continuación, coloque una lámina de PMMA o un trozo de cinta adhesiva de doble cara sobre la plataforma del grabador. Ajuste el enfoque del láser de dióxido de carbono utilizando la barra de calibración y el láser visible de helio-neón. Después, grabe el patrón sobre el sustrato. Al terminar, tome el sustrato con el patrón, retire las piezas no deseadas y use un chorro de nitrógeno para limpiar la superficie de cualquier residuo restante. Repita este proceso para cada componente del chip. Ensamble el chip microfluídico de esfuerzo cortante químico. Para lograrlo, una tres láminas del patrón de PMMA con diseño de esfuerzo cortante químico utilizando dos piezas de cinta adhesiva de doble cara grabada. Use pegamento cianocrilato para fijar un adaptador de acrílico con rosca en el centro a la capa superior de PMMA del chip, alineando las roscas y los orificios. Estos adaptadores servirán como entradas y salidas de medio y conectores de puente salino. Luego, agregue una pieza adicional de cinta adhesiva de doble cara de 0,7 mm de espesor en la parte inferior del chip y fije el chip a una placa de Petri de 10 cm de diámetro. Una vez ensamblado, coloque el chip en una cámara de vacío durante toda la noche. Ahora ensamble el chip de campo químico-eléctrico. Fije la lámina de PMMA grabada para el chip de campo químico-eléctrico con cinta adhesiva de doble cara a una placa de Petri de 10 cm de diámetro. Antes de usar los chips, expóngalos a UV durante 30 minutos para esterilizarlos. A continuación, conecte las entradas de los chips a jeringas de 3 ml llenas con PBS mediante tubos plásticos y tuercas de rosca manual. De manera similar, conecte las salidas a un tubo de desecho. Presione lentamente el émbolo de la jeringa para cebado de los canales fluidos con PBS. Mueva la jeringa hacia adelante y hacia atrás para eliminar las burbujas, luego coloque los chips dentro de una incubadora durante toda la noche. Para configurar los chips de campo químico-eléctrico, llene las tuercas tubulares con agarosa al 3 % para establecer los puentes salinos. Luego, coloque los electrodos de cloruro de plata en las tuercas tubulares. Cultive células de cáncer de pulmón CL1-5 en D-MEM suplementado con 10 % de FBS hasta que alcancen una confluencia del 90 %. Luego, aspire el medio. Lave las células una vez con PBS previamente calentado. Y agregue 2 ml de una solución tampón de tripsina al 0,5 % a una placa de 10 cm de diámetro. Vuelva a colocar las células en el incubador a 37 °C.
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Descripción general
Este estudio presenta dispositivos microfabricados integrados con componentes fluidicos que crean una plataforma in vitro para estudios celulares, imitando de cerca el microambiente in vivo. La investigación se centra en chips microfluídicos basados en polimetilmetacrilato diseñados para investigar las respuestas celulares a diversos estímulos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microfluídica
- Biología Celular
- Estudios In Vitro
Antecedentes
- Los dispositivos microfabricados mejoran el estudio de los entornos celulares.
- Los componentes fluidicos permiten un control preciso de las condiciones experimentales.
- Comprender las respuestas celulares es crucial para diversas aplicaciones biológicas.
- El polimetilmetacrilato es un material versátil para aplicaciones microfluídicas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una plataforma para estudiar las respuestas celulares en un entorno controlado.
- Imitar las condiciones in vivo utilizando tecnología de microfluidos.
- Investigar los efectos de estímulos químicos, eléctricos y de esfuerzo cortante sobre las células.
Métodos Utilizados
- Diseño y fabricación de chips microfluídicos utilizando polimetilmetacrilato.
- Integración de componentes fluídicos para un control experimental mejorado.
- Aplicación de diversos estímulos para evaluar las respuestas celulares.
- Experimentación in vitro para simular condiciones in vivo.
Resultados principales
- Desarrollo exitoso de chips microfluídicos para estudios celulares.
- Se demostró la capacidad de controlar eficazmente las condiciones ambientales.
- Se observaron respuestas celulares distintas frente a diferentes estímulos.
- Se obtuvieron conocimientos sobre las interacciones entre las células y su microambiente.
Conclusiones
- La plataforma microfluídica es una herramienta valiosa para estudiar el comportamiento celular.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de las respuestas celulares en un entorno controlado.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir pruebas de fármacos y modelado de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las plataformas microfluídicas que permiten un control preciso sobre estímulos químicos, eléctricos y de esfuerzo cortante ofrecen a la I+D de biofármacos un enfoque escalable para reducir los riesgos en la validación de dianas mediante la simulación de microentornos complejos in vivo. Estos dispositivos basados en PMMA aumentan el rendimiento experimental para el cribado de respuestas celulares bajo estímulos coexistentes, facilitando conocimientos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. La tecnología ayuda a priorizar dianas con mayor confianza predictiva antes de destinar recursos a la identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las respuestas celulares a gradientes químicos, campos eléctricos y estrés cortante para esclarecer la participación de vías en mecanismos de enfermedad.
- Valor operativo: Los sustratos de PMMA permiten una fabricación de bajo costo y rápida mediante ablación láser, lo que favorece el diseño iterativo en la prueba de hipótesis específicas.
- Valor predictivo: Cuantifica la producción de especies reactivas de oxígeno y la migración celular bajo estímulos definidos, proporcionando lecturas funcionales para la reducción de riesgos del blanco terapéutico.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera cinco gradientes de concentración con gradientes concurrentes de tensión cortante o campo eléctrico, lo que permite la selección multiparamétrica en un solo dispositivo.
- Valor operativo: Reduce la repetición de experimentos al integrar múltiples condiciones de estímulos, mejorando la eficiencia del ensayo en la selección de bibliotecas de compuestos o siARN.
- Escalabilidad: Compatible con flujos de trabajo estándar de microscopía e incubación, lo que facilita su adopción en cascadas de selección.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Utiliza células de cáncer de pulmón CL1-5 como modelo relevante para la enfermedad, con el fin de estudiar fenotipos inducidos por el microambiente.
- Reducción Mecanística de Riesgos: Aísla las contribuciones de los estímulos químicos, eléctricos y mecánicos en las respuestas celulares, lo que orienta estrategias de terapia combinada.
- Alineación Preclínica: Resultados como la migración y el estrés oxidativo se correlacionan con características clave relacionadas con metástasis e invasividad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Los chips microfluídicos funcionan como una plataforma de ensayo en fase de descubrimiento que sirve de puente entre la validación del blanco y el cribado inicial de compuestos activos, al proporcionar fenotipos celulares cuantitativos y sensibles a estímulos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre cómo las señales del microentorno modulan el comportamiento celular en modelos de cáncer y otras enfermedades.
- Selección: Permite la evaluación paralela de las respuestas celulares a lo largo de gradientes de concentración química y estímulos físicos, aumentando la densidad de datos por experimento.
- Análisis: Genera resultados cuantificables, incluyendo la detección de ERO mediante fluorescencia y métricas de migración por lapso de tiempo para comparaciones objetivas.
- Investigación Traducional: Utiliza una línea de cáncer de pulmón metastásico para vincular las respuestas al microentorno con fenotipos de invasividad relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: El diseño basado en PMMA permite la replicación entre laboratorios y proyectos, garantizando una administración consistente de estímulos en estudios de mecanobiología o farmacología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al permitir la aplicación controlada de un solo estímulo o estímulos coexistentes para aislar las contribuciones de variables individuales.
- Valor operativo: Estandariza la administración de estímulos mediante la generación reproducible de gradientes, minimizando la variabilidad entre réplicas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar lecturas multiparamétricas de eficacia y toxicidad en condiciones fisiológicamente relevantes.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización de objetivos ajustada al riesgo al identificar compuestos que modulan respuestas celulares específicas a estímulos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en diseño de microfluidos, ablación láser de PMMA y ensamblaje de interfaces fluidicas.
- Depende del acceso a un grabador láser de CO2, esterilización UV y equipos para cebado de fluidos, como jeringas y tubos.
- Necesita la estandarización del siembra celular, el momento de aplicación del estímulo y la normalización de las lecturas entre diferentes equipos.
- La adaptación a otros tipos celulares puede requerir la optimización de las dimensiones de los canales y las tasas de flujo para mantener la tensión cortante y la integridad del gradiente.
- Las limitaciones prácticas incluyen la formación de burbujas durante el cebado y el desprendimiento de electrodos en configuraciones con campo eléctrico, como se indica en el protocolo.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Chip Design and Fabrication
1:57
Chip Assembly
4:37
Cell Preparation and Experimental Setup
6:02
Experimental Setup
7:32
Data Analysis
8:22
Results: The Effects of Chemical Stress, Shear Stress, and Electrical Fields on Lung Cancer Cells
9:47
Conclusion
