Name: RT-PCR cuantitativo de alto rendimiento en muestras de C. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende RT-PCR cuantitativo de alto rendimiento en C. elegans usando nanofluidica sin aislamiento de ARN. Este método permite obtener más de 9.000 resultados en dos días con alta sensibilidad.

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Agradecemos a Sharlene Murdoch y a las instalaciones del Instituto Babraham por su apoyo. JLP fue apoyado por el Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) y OC es apoyado por ERC 638426 y BBSRC [BBS/E/B000C0426].

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Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, se muestra que el protocolo worm-to-CT es un método rápido y eficiente para extraer ARN de gusanos individuales o un pequeño grupo de gusanos. El alto rendimiento ofrecido por el sistema nanofluídico lo hace ideal para la cuantificación de mediciones de variabilidad inter-individuales. Además, la alta sensibilidad de este método permite la detección de genes expresados a niveles bajos que caen por debajo de la detección cuando se utilizan tecnologías de ARN-seq de un solo gusano9.
Al considerar la elección del método para preparar cDNA a partir de gusanos individuales. Ly et al.29 optimizó un protocolo que se basa en la proteinasa K para la digestión de cutículas. La cutícula es un obstáculo importante para el aislamiento de moléculas de gusanos y proteinasa K proporciona un método eficaz para romperlo. Sin embargo, la proteína K tiene que estar inactivada por calor para poder utilizar enzimas para la transcripción inversa. Mientras que Ly et al. utilizaron una exposición de 10 minutos a 96 °C, este paso se evitó en este protocolo porque el ARN es fácilmente degradable. En lugar de usar la proteína K, se utilizaron ciclos repetidos de congelación y descongelación para romper la cutícula. El congelamiento-deshielo es un método eficaz para romper la cutícula porque más ARN se puede aislar por gusano. Ly et al. informan que el ARN total extraído por gusano es de 35 ng usando proteinasa K, mientras que este protocolo obtiene 51,75 ng ± 6,74 SEM de ARN total por gusano. La evitación de la exposición al calor junto con los pasos de preamplificación aparentemente amplía el rango dinámico de detección de Worm-to-CT en comparación con los protocolos estándar. Informe de valores absolutos de Ct de 21,1 ± 0,15 para hsp-16,2 y 22,8 ± 0,17 para hsp-70 después del choque térmico. Utilizando las mismas condiciones de choque térmico (1 h a 30 °C), este protocolo obtiene valores absolutos de Ct de 17,93 ± 0,57 para hsp-16,2 y 21,13 ±0,33 para hsp-70. Esto indica que el método de lisis congelación-deshielo proporciona mayores rendimientos de ARN y es más apropiado para transcripciones de baja expresada.
Los sistemas nanofluídicos son ideales cuando se investiga un conjunto determinado de transcripciones de objetivos y el uso de muestras más pequeñas (chip multi-matriz) o más grandes (chip de una sola matriz) que permiten la adaptación a la escala del experimento. Para obtener una imagen imparcial de todas las transcripciones expresadas en un solo gusano, la elección obvia es utilizar la secuenciación de ARN. Sin embargo, si el enfoque del experimento es un conjunto más pequeño pero todavía relativamente grande de genes objetivo, es más rentable utilizar este protocolo, siempre que el investigador tenga acceso a una máquina PCR de nanofluídica. El costo de los reactivos del sistema nanofluídico y un chip de una sola matriz se estima en aproximadamente £ 13 por gusano, mientras que los costos de los reactivos para la secuenciación de un solo gusano serían de aproximadamente £ 60 por gusano, sin incluir los costos de secuenciación.
Al considerar qué plataforma PCR utilizar, el método Worm-to-CT acoplado a qPCR nanofluídico ofrece ventajas con respecto al tiempo y el rendimiento. Es posible obtener 9.216 resultados rt-qPCR en aproximadamente 2 días de trabajo, mientras que la amplificación del mismo número de objetivos utilizando una plataforma qPCR estándar tomaría aproximadamente 5 semanas de trabajo utilizando 96 ensayos de placa de pozo, ejecutando cuatro placas al día. Sin embargo, si el número de objetivos a probar es menor, entonces es más rentable usar Worm-to-CT junto con una máquina qPCR estándar. Los chips de matriz única no se pueden volver a ejecutar, por lo que ejecutar pozos vacíos disminuye la rentabilidad.
Una limitación del método es la formación potencial de atenuadores de imprimación durante el paso multiplexante, pero esto ocurre en menos del 1% de los casos. Aunque el protocolo de gusano a TC es eficiente y proporciona resultados fiables cuando se aplica a gusanos individuales, hay una tasa de fallos de aproximadamente el 5%, que probablemente corresponde a casos en los que el gusano permanece atrapado en la tapa o en la parte superior del tubo durante el paso de recolección.
Juntos, este método versátil y confiable ofrece un mayor rendimiento y sensibilidad en comparación con técnicas más estándar. Este método puede ser muy útil para la validación de pantallas de alto rendimiento y es una excelente opción para monitorear o validar los niveles de expresión génica de un solo gusano. Este método se puede aplicar a otras técnicas desafiantes, como la cuantificación de la expresión génica de tejidos aislados. Por ejemplo, el aislamiento de tejidos completos, como el intestino, las gónadas o las células aisladas por los FACs, proporciona suficiente material para realizar experimentos de secuenciación de ARN. Sin embargo, cantidades limitadas de material a menudo conducen a lecturas duplicadas, lo que impide la cuantificación de transcripciones raras. En este escenario, el uso de tecnología basada en nanofluídica debe proporcionar una mayor sensibilidad a los experimentos y aumentar la rentabilidad si los investigadores necesitan monitorear sólo un subconjunto de todas las transcripciones en esos tejidos o células.

La optimización de la secuenciación de ARN unicelular y qPCR reveló que los pulsos o ráfagas transcripcionales pueden conducir a una variación masiva en el número de moléculas de ARN por célula1. Además, estas tecnologías descubrieron una heterogeneidad celular sustancial que antes no se perdía por las mediciones transcriptómicas a granel estándar. Dependiendo del contexto, cierta variabilidad transcripcional unicelular es causada por la composición celular mixta de los tejidos. Sin embargo, incluso en las poblaciones celulares isogénicas cultivadas bajo el mismo entorno hay heterogeneidad transcripcional generalizada2,3. Esta "variabilidad biológica" se identifica cada vez más como una propiedad omnipresente de las redes celulares, desde bacterias hasta el hombre. En algunos casos, puede tener consecuencias fenotípicas en el desarrollo, progresión del cáncer, latencia del VIH, y respuesta a la quimioterapia4,5.
El nematodo Caenorhabditis elegans es un organismo modelo único con características ideales para estudiar las causas y consecuencias de la variabilidad biológica entre individuos. Estos nematodos son un organismo modelo simple compuesto por 959 células, y su cutícula transparente las hace aptos para estudios de imágenes in vivo6. C. elegans es una especie hermafrodita que se reproduce predominantemente a través de la auto fertilización; esto dio lugar a cepas de laboratorio isogénicas. A pesar de la isogenicidad y las condiciones de cultivo controladas, muchos fenotipos y transcripciones son variables entre los individuos, lo que sugiere que las diferencias estocásticas o microambientales contribuyen a la heterogeneidad entre los individuos7,8. Tal variabilidad en la expresión génica tiene múltiples consecuencias de aptitud, incluyendo variabilidad en la penetrancia de mutaciones, supervivencia, tiempo de desarrollo, y fecundidad7,8,9. Debido a estas características, los estudios de un solo gusano proporcionan la oportunidad sin precedentes de estudiar la variabilidad biológica en todo un organismo.
Hay una necesidad fundamental en el campo para desarrollar y optimizar tecnologías para la detección precisa de transcripciones a un nivel de un solo gusano. Las nuevas tecnologías, como la secuenciación de ARN de un solo gusano10,la secuenciación de ARN de tejidos aislados11y la secuenciación de una sola célula12 ya están disponibles para C. elegans. Sin embargo, sigue existiendo un desafío principal: al monitorear la interindividualidad, los genes débilmente expresados a menudo caen por debajo de los niveles detectables13. Esto es particularmente relevante para las transcripciones raras aisladas de pequeñas cantidades de material de partida, ya que existe una relación inversa y bien establecida entre la expresión media y la varianza técnica, lo que a menudo hace que las transcripciones raras caigan por debajo de los recortes estadísticos13. La optimización de las tecnologías qPCR multiplexadas de alto rendimiento ha demostrado ser útil para estudios monocelulares de mamíferos, en particular cuando se estudia la expresión de transcripciones raras14,15. Esta tecnología también se puede utilizar para fines de benchmarking y validación de otras tecnologías de un solo gusano.
Worm-to-CT es un método rápido y robusto adaptado de un kit utilizado en estudios de biología celular, para la preparación de cDNA de un solo gusano. cDNA obtenido por este método junto con la tecnología qPCR nanofluídica multiplexada fue elegido porque proporciona un mayor rendimiento experimental, un rango dinámico más amplio de detección y ha sido validado para propósitos de una sola célula14,15. La preparación de cDNA descrita también es aplicable para su uso con tecnologías PCR estándar. El rendimiento se incrementa de dos maneras: En primer lugar, la preparación de cDNA es más rápida y fiable que la extracción tradicional de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo, porque los gusanos se agregan directamente al búfer de lisis, omitiendo el aislamiento directo del ARN fácilmente degradable. En segundo lugar, la utilización de tecnologías nanofluídicas aumenta significativamente el número de muestras y objetivos que se pueden ejecutar simultáneamente. En este papel, se comparan dos chips: un chip de una sola matriz y un chip multi-array. Un chip de una sola matriz puede ejecutar 96 gusanos individuales y 96 conjuntos de imprimación, lo que resulta en 9.216 reacciones por experimento. Para lograr un rendimiento similar utilizando tecnologías qPCR estándar requeriría 96 experimentos qPCR separados, utilizando 96 placas de pozo. El chip multi-array más pequeño y flexible consta de seis matrices de 12 x 12 que dan como resultado 864 reacciones. La fiabilidad y sensibilidad superiores del método se ven impulsadas por la tecnología nanofluídica y por la introducción de un paso de preamplificación. El método presentado en este artículo está destinado a ser utilizado junto con un algoritmo estadístico de última generación para extraer varianza biológica. Este artículo presenta el protocolo para la preparación rápida de cDNA y qPCR de alto rendimiento para muestras de gusanos de un solo gusano y por lotes; el algoritmo se publicará en otro lugar. Para este protocolo, la organización de cada chip debe prepararse antes del experimento. La Tabla 1 y la Tabla 2 muestran ejemplos de estos planes para un chip multi-matriz y de una sola matriz, respectivamente. También hay información general del protocolo Worm-to-CT detallada en la Figura 1 y la ejecución de los chips multi-matriz y de matriz única en la Figura 2.

<table><tbody><tr><td>100&micro; M cebadores de stock para genes de interés.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X Fluido de tinte de unión al ADNigm</td><td></td><td>100-7609</td><td>para chip 96.96 (chip de matriz única)</td></tr><tr><td>2X Fluido de reactivo de carga</td> de <td>ensayoigm</td><td>100-7611</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 384 pocillos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 8 tiras Bloque de hielo de</td> 96 pocillos <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 96 pocillos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>Referenciado en todo el manuscrito como "Single-Array Chip"</td></tr><tr>Cinta <td></td><td></td><td></td><td>de sellado de 96 pocillos</td></tr><tr><td>BioMark & El software EP1</td><td>Fluidigm</td><td>101-6793</td><td>contiene: software de recopilación de datos Biomark HD, software de análisis de PCR en tiempo real, software de análisis de genotipado SNP, software de análisis de PCR digital, software de análisis de curva de fusión</td></tr><tr><td>BioMark o sistema BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>100-2451 K1</td><td>Referenciado en todo el manuscrito como "termociclador de nanofluidos"</td></tr> <tr><td>Kit de fluido de línea de control para IFC 96.96 y FlexSix</td><td>Fluidigm</td><td>89000021</td><td>Referenciado en todo el manuscrito como "fluido de línea de control"</td></tr><tr><td>Tampón de suspensión de ADN</td><td>TEKnova</td><td>T0021</td><td></td></tr><tr><td>tapas de</td><td></td><td></td><td></td>PCR abovedadas</tr><tr><td>Exonucleasa I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293L</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de reacción de exonucleasa I</td><td>New England BioLabs</td><td>B0293S</td><td></td></tr><tr><td>FLEXsix DELTAgene Reactivo de muestra</td><td>Fluidigm</td><td>100-7673</td><td>referenciado en todo el manuscrito como "reactivo de muestra"</td></tr><tr><td>FLEXsix Gene Expression IFC</td><td>Fluidigm</td><td>100-6308</td><td>referenciado en todo el manuscrito como "Multi-Array Chip"</td></tr><tr><td>Guía del usuario de análisis de PCR en tiempo real Fluidigm</td><td></td><td>68000088</td><td>Este es el protocolo utilizado como base para la sección 2 del protocolo, al que se hace referencia en el manuscrito.</td></tr><tr><td>Controlador IFC MX</td><td>Fluidigm</td><td>68000112 I1</td><td>Referenciado en todo el manuscrito como "máquina de cebado de PCR nanofluida"</td></tr><tr><td>Controladores IFC SOFTWEAR</td><td>FLUIDIGM</td><td>100-2297</td><td>Contiene todo el desgaste suave y los scripts necesarios para hacer funcionar el controlador IFC MX</td></tr><tr><td>nitrógeno líquido en dewar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>StarLab</td><td>C1301B-230V</td><td>Se utiliza para reducir las tiras de tubos de PCR en el protocolo.</td></tr><tr><td>Centrifugadora de placas de agua</td><td></td><td></td><td></td>sin nucleasas</tr><tr><td></td><td>Labnet K4050725</td><td></td><td>mini spinner de placas, mps 1000. referenciado a través del protocolo como "spinner de placa de sobremesa"</td></tr><tr><td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td><td>invitrogen</td><td>4402955</td><td>Este kit es el que se adapta para su uso en nematodos en el protocolo Worm-to-CT. Contenido: Almacene la solución de parada, DNasa I y la mezcla de enzimas RT 20X a -20 °C. Almacene la solución de lisis, 2 tampones SYBR RT (referenciados en todo el manuscrito como tampón RT) y Power SYBR&reg; Green PCR Master Mix (referenciado a lo largo del manuscrito como PCR Master Mix). Este kit es para 400 reacciones, también hay kits disponibles para 40 y 100 reacciones.</td></tr><tr><td>PreAmp Master Mix</td><td>Fluidigm</td><td>100-5580, 100-5581</td><td></td></tr><tr><td>Transcripción inversa Master Mix&mdash; 480 reacciones</td><td>Fluidigm</td><td>100-6299</td><td>Un tubo también disponible para 96 reacciones (PN100-6298)</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>libre de rnasa</tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix con bajo ROX</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>172-5211</td><td>referenciado en todo el manuscrito como "supermix de sonda fluorescente"</td></tr><tr><td>Tampón TE de termociclador</td><td></td><td></td><td></td>estándar de 96 y 384 pocillos</tr><tr><td>(10 mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td><td>TEKnova</td><td>T0224</td><td>Referenciado en todo el manuscrito como Tampón Tris-EDTA</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000031</td><td>Referenciado en todo el texto como "mezclador térmico"</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td>15596026 Referenciado a través del protocolo como "tiocianato de guanidio-fenol-cloroformo"</td></tr><tr><td>Baño</td><td></td><td></td><td></td> de agua tibia</tr></tbody></table>

rt-pcr cuantitativo de alto rendimiento en muestras de c. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

Este artículo presenta un ensayo de PCR cuantitativa de transcripción inversa de alto rendimiento (RT-qPCR) para Caenorhabditis elegans que es rápido, robusto y altamente sensible. Este protocolo obtiene mediciones precisas de la expresión génica de gusanos individuales o de muestras a granel. El protocolo presentado aquí proporciona una nueva adaptación de los métodos existentes para la preparación complementaria del ADN (CDNA) acoplado a una plataforma rt-qPCR nanofluídica. La primera parte de este protocolo, denominado 'Worm-to-CT', permite la producción de cDNA directamente a partir de nematodos sin necesidad de aislamiento previo de ARNm. Aumenta el rendimiento experimental al permitir la preparación de cDNA a partir de 96 gusanos en 3,5 h. La segunda parte del protocolo utiliza la tecnología nanofluídica existente para ejecutar RT-qPCR de alto rendimiento en el cDNA. Este trabajo evalúa dos chips nanofluídicos diferentes: el primero ejecuta 96 muestras y 96 objetivos, lo que resulta en 9.216 reacciones en aproximadamente 1,5 días de trabajo en el banco. El segundo tipo de chip consta de seis matrices de 12 x 12, lo que resulta en 864 reacciones. Aquí, el método de gusano a TC se demuestra cuantificando los niveles de ARNm de genes que codifican proteínas de choque térmico de gusanos individuales y de muestras a granel. Se proporciona una extensa lista de imprimaciones diseñadas para amplificar el ARN procesado para la mayoría de los genes de codificación dentro del genoma de C. elegans.

Validación de Worm-to-CT como método de preparación de cDNA
Para probar si el protocolo worm-to-CT es un método de extracción cDNA válido, se comparó con los métodos estándar de extracción de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo. Los resultados se muestran en la Figura 3, donde cDNA se preparó a partir de un promedio de ~ 1,000 gusanos utilizando técnicas estándar de extracción de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo22 y de 30 gusanos utilizando el método worm-to-CT. Las muestras fueron impactadas por calor simultáneamente (30 min a 34 °C). A nivel mundial, los niveles de expresión de hsp-70 mRNA por cada 100 ng de ARN total eran comparables utilizando ambos métodos. Sin embargo, en el caso de la expresión hsp-70 más alta (es decir, en N2 después de un choque térmico) los niveles de expresión eran más altos con el método de gusano a TC, lo que indica una sensibilidad mejorada.
Para determinar si se podía reproducir una disminución esperada de la expresión hsp en hsf-1(sy441)23, se pudo reproducir una mutación en el regulador transcripcional principal de los chaperones moleculares23,24, , se pudo reproducir la inducción de chaperona transcripcional después de un breve choque térmico. Con ambos métodos se detectó una disminución de la inducción hsp-70 en animales hsf-1(sy441). Esto era esperado, porque los animales mutantes hsf-1(sy441) exhiben una disminución de la capacidad de inducir chaperones debido a un truncamiento en el dominio de transactivación de HSF-1. En el for guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo extracción hsp70 disminuyó en un 82,7% en comparación con los controles y 92,3% para gusano a TC en comparación con animales de tipo salvaje (Figura 3). Los resultados fueron comparables entre ambos métodos y comparables a los informes anteriores23. Estos resultados indican que el método worm-to-CT es una alternativa válida a las técnicas estándar de síntesis de cDNA.
Validación de la plataforma PCR nanofluídica utilizada para amplificar los objetivos de ARNm
Para probar la consistencia de los resultados utilizando qPCR nanofluídico para la amplificación de transcripción, los resultados de PCR obtenidos del método a granel worm-to-CT se compararon tanto en un sistema qPCR estándar(Tabla de Materiales)como en un sistema qPCR nanofluídico utilizando un chip multi-matriz. El cambio de pliegue en la expresión de tres genes diferentes, sma-3 (Figura 4A), sma-10 (Figura 4B), y dnj-26, fue monitoreado (Figura 4C) en animales que llevan un alelo nulo en dbl-1 (dbl-1(nk3))25 en comparación con contrapartes de tiposalvaje. Dbl-1 codifica el único ligando de la vía de señalización de proteína morfogenética ósea (BMP). sma-3 y sma-10 son genes que codifican ortoólogos SMAD, componentes clave de la cascada de señalización BMP. Dnj-26 codifica una chaperona molecular, un objetivo de la señalización BMP. Estos resultados muestran poca o ninguna diferencia en el cambio de pliegue comparando los resultados de los dos métodos, lo que resulta en valores P no significativos en 0.3113, 0.2635 y 0.3481 para sma-3, sma-10y dnj-26,respectivamente. En conjunto, estos resultados muestran que el método worm-to-CT aplicado a las muestras a granel es una manera eficiente y rápida de extraer ARN de pocos gusanos y proporciona datos confiables cuando se combina con sistemas PCR estándar o plataformas qPCR basadas en nanofluidics de alto rendimiento.
Comparación entre los niveles de expresión obtenidos por muestras a granel con promedios obtenidos de gusanos individuales
Los niveles de expresión relativa se calcularon utilizando cDNA obtenido a partir de muestras masivas (25 gusanos) o a partir de un promedio de 36 muestras de gusano único (Figura 5). Ambos CDA se obtuvieron utilizando el método Worm-to-CT y se amplificaron utilizando la tecnología PCR nanofluídica. Como se observa en la Figura 5A–C, para todos los acompañantes probados (es decir, hsp16.1, F44E5.4, hsp-70),los métodos detectaron niveles de expresión comparables. Estos resultados indican que los parámetros obtenidos de gusanos individuales son fiables.
Aplicación de worm-to-CT acoplada a la tecnología de nanofluídica para estimar los parámetros de expresión génica de un solo gusano
Debido a que el chip de matriz única permite la supervisión de hasta 96 transcripciones de destino en 96 muestras individuales, por lo tanto, es adecuado para monitorear la variabilidad individual en la expresión de transcripción entre gusanos individuales. La Figura 6A presenta un resultado representativo que muestra la expresión media de múltiples transcripciones hsp de gusanos individuales después de un choque térmico corto. Como se observa en la figura, la variabilidad en la expresión de transcripciones difirió dramáticamente entre diferentes genes (Figura 6A). Para obtener más información, el coeficiente de variación (CV) se calculó dividiendo la desviación estándar por la media de los niveles de expresión26 (Figura 6B). Se supervisaron tres genes cuyos valores de CV han sido previamente estimados por métodos alternativos (datos inéditos). Dos transcripciones estables(ife-1 y Y45F10D.4)y una variable(nlp-2927)mostraron su variabilidad esperada. El gráfico también muestra claramente la conocida relación inversa entre los valores de variabilidad y los niveles de expresión26 (Figura 6B).
Las réplicas técnicas son de suma importancia para garantizar la reproducibilidad al utilizar muestras a granel. Sin embargo, este no es necesariamente el caso de los experimentos de una sola célula14,15,28. Para determinar si el uso de réplicas técnicas es necesario para la estimación de parámetros al utilizar muestras de un solo gusano, se cosecharon 28 gusanos individuales, tras un breve choque térmico, y se procesaron utilizando triplicados técnicos. Se compararon los valores cv calculados a partir de datos de un solo gusano obtenidos en triplicato (puntos azules en la Figura 7,CV técnico) en comparación con los de cada transcripción obtenida de gusanos individuales (puntos rojos en la Figura 7,variabilidad biológica). Por cada transcripción probada, los CV técnicos eran inferiores a los CV biológicos, lo que indica que no se requerían triplicatos técnicos para la estimación de parámetros. El hecho de que no se requieran réplicas técnicas aumenta el rendimiento del experimento sin comprometer la calidad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del Protocolo de gusano a TC. Esta figura muestra una breve descripción general de los diferentes pasos necesarios para ejecutar gusanos a través del protocolo worm-to-CT. Se muestran dos métodos opcionales para el paso de transcripción inversa; estos son métodos intercambiables para cualquier tipo de chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig02.jpg"> Figura 2: Visión general de la preparación y funcionamiento del qPCR nanofluídico. Esta figura representa los preparativos para ejecutar el sistema qPCR nanofluídico utilizando un chip multi-matriz y un chip de una sola matriz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig03.jpg"> Figura 3: El protocolo de gusano a TC en muestras masivas proporcionó resultados fiables. Comparación del protocolo de gusano a TC con la extracción regular de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo22 en muestras a granel. En consonancia con los hallazgos anteriores, en hsf-1(sy441)mutantes23, los niveles de transcripciones hsp en respuesta a choque de calor disminuyeron. Los histogramas anteriores representan la inducción de hsp-70 en ausencia de (-), o después (+) un choque térmico corto de 30 min a 34 °C. El cDNA se obtuvo utilizando la extracción de guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo aplicada a 1.000 gusanos (izquierda) o utilizando el método de gusano a TC aplicado a 30 gusanos agrupados (derecha). Se compararon los niveles de expresión de hsp-70 por 100 ng de ARN total obtenido por cada método. Como era de esperar, en hsf-1(sy441) la inducción transcripcional de hsp-70 en respuesta al choque térmico disminuyó significativamente en un 82,7% utilizando guanidium tiocyanato-fenol-cloroformo y en un 92,3% utilizando el método worm-to-CT. Los niveles de ARNM de los genes objetivo se normalizaron contra el promedio de los tres genes de limpieza cdc-42, pmp-3y ire-1. Cada punto representa una réplica biológica. Los datos se transformaron para su análisis estadístico, ya que no cumplían los convenios necesarios para el análisis paramétrico. El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA unidireccional RM utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Tipo salvaje = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Las barras denotan el error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig04.jpg"> Figura 4: Los patrones de expresión eran consistentes entre los sistemas qPCR estándar y qPCR nanofluídicos. (A) El nivel de expresión de ARNm-3 (A), sma-10 (B) o dnj-26 (C) se determinó a través de qPCR regular y qPCR nanofluídico (chip multi-matriz) a partir de tres réplicas biológicas de cDNA generadas a través de Gusano a TC de la cepa de tipo salvaje (N2) y la cepa knockout dbl-1(nk3) 25. Se determinaron niveles relativos de expresión de ARNm para cada cepa utilizando el método Delta-Ct21. El cambio de pliegue se determinó dividiendo los niveles de expresión obtenidos en gusanos dbl-1(nk3) por los niveles de ARNM correspondientes en la cepa N2. Como se muestra en el panel A,los patrones eran consistentes para ambos métodos en cada réplica biológica individual. (B) y (C) son los mismos que (A) para los niveles de sma-10 y dnj-26 mRNA, respectivamente. Los niveles objetivo de ARNm se normalizaron con los genes de limpieza cdc-42 y pmp-3. Se calculó un análisis estadístico para cada gen utilizando una prueba en T emparejada comparando los resultados de las tres réplicas biológicas producidas a través de qPCR estándar y las generadas a través de qPCR nanofluídico. Los valores P de estas comparaciones fueron 0,3113, 0,2635 y 0,3481 para sma-3, sma-10y dnj-26,respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2.jpg"> Figura 5: El uso del método de gusano a TC en muestras masivas o en gusanos individuales proporcionó niveles de expresión similares cuando se normalizó por gusano. Los niveles de expresión de (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4, y (C) hsp-70 (C12C8.1) fueron analizados en animales adultos jóvenes en ausencia de choque térmico ya sea mediante la realización de gusano a TC en una mayor parte de 25 animales, o en 36 individuos individuales. Cuando los datos se normalizaron por gusano, no hubo ninguna diferencia significativa entre los niveles obtenidos por gusano para cada transcripción utilizando ambos métodos. Los niveles de ARNM de los genes objetivo se normalizaron con respecto a la media de los tres genes de limpieza cdc-42, pmp-3y ire-1. Las barras representan el error estándar de la media. Estadísticas = t-test emparejado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig06.jpg"> Figura 6: Rt-qPCR de alto rendimiento en gusanos individuales que utilizan el método worm-to-CT podría monitorear la variabilidad inter-individual en la expresión génica. (A) Los niveles medios de expresión de 53 transcripciones obtenidas tras la exposición a un choque térmico corto (30 min a 34 °C). Las cajas representan la distribución de la expresión media de ARNm de gusanos individuales (se utilizó un promedio de tres réplicas técnicas por gusano individual). Los puntos representan niveles de expresión en 28 gusanos individuales. Los niveles de ARNM de los genes objetivo se normalizaron con respecto a la media de los tres genes de limpieza cdc-42, pmp-3y ire-1. (B) El coeficiente de variación26 (CV) en función de la expresión media de ARNm para 53 transcripciones después de la exposición a un choque térmico corto se calculó a partir de 28 animales individuales (datos sin procesar que se muestran en el panel B). El conjunto de transcripciones incluye la transcripción variable nlp-29 27 y dos transcripciones estables(ife-1 y Y45F10D.4; datos inéditos). El CV es la relación de la desviación estándar con la media. Este CV se utilizó para estimar la variabilidad inter-individual en la expresión de transcripción entre gusanos individuales. Como era de esperar, la variabilidad inter-individual se escaló con niveles de expresión media disminuidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig07.jpg"> Figura 7: Las réplicas técnicas no eran necesarias al analizar la variabilidad inter-individual en la expresión génica utilizando un chip nanofluídico. Los datos presentados en este gráfico se obtuvieron en 28 gusanos individuales después de un choque térmico corto (30 min a 34 °C). Cada punto rojo representa el coeficiente de variación (CV) de los niveles medios de expresión de transcripción para una transcripción tal como se indica entre 28 gusanos individuales (bio CV). Cada punto azul representa el CV de los niveles de expresión entre tres réplicas técnicas obtenidas de un solo gusano, según la transcripción a la que se dice (CV técnico). Este gráfico muestra que la variabilidad técnica (entre las réplicas técnicas) era mucho menor que la variabilidad biológica (entre gusanos individuales), lo que sugiere que no es necesario realizar réplicas técnicas en una matriz de expresión génica nanofluídica al ensayo de la expresión génica en gusanos individuales, de forma similar a los estudios unicelulares14,15,28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Planifique el diseño de un chip de varias matrices. La tabla anterior muestra un diseño simple que se puede utilizar al planear una ejecución de chip de varias matrices. A la izquierda están los espacios que deben llenarse con los objetivos de primer de interés y a la derecha son espacios que deben llenarse con las muestras de interés. Cada ensayo y matriz de muestras se empareja en cuanto a números a través del chip. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Planifique el diseño de un chip de matriz única. La tabla anterior muestra un diseño simple que se puede utilizar al planear una ejecución de chip de una sola matriz. A la izquierda hay espacios que deben llenarse de objetivos de interés y a la derecha son espacios que deben llenarse con las muestras de interés. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Lista de imprimaciones RT-qPCR utilizadas en este estudio. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Cuadro suplementario 1: Imprimaciones de la base de datos de imprimaciones RT-qPCR. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_S1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

En este artículo se describe un protocolo de alto rendimiento para una determinación rápida y confiable de los niveles de expresión génica en muestras de C. elegans simples o masivas. Este protocolo no requiere aislamiento de ARN y produce cDNA directamente a partir de muestras. Se puede utilizar junto con plataformas qPCR nanofluídicas nanofluídicas multiplexadas de alto rendimiento en tiempo real.

RT-PCR cuantitativo de alto rendimiento en muestras de C. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Nuestro protocolo mejoró tanto el rendimiento como la eficiencia del tiempo para obtener datos de RT-qPCR directamente de una sola muestra o muestras pequeñas a granel sin necesidad de aislamiento de ARN. Con este protocolo, se pueden obtener más de 9.000 resultados de RT-qPCR en solo dos días de trabajo de laboratorio, un proceso que normalmente llevaría unas cinco semanas con la qPCR estándar de 96 pocillos. Este protocolo proporciona un ensayo RT-qPCR más rápido, robusto y altamente sensible en C. elegans, que es ideal para monitorear la variabilidad interindividual en la expresión génica entre gusanos isogénicos.Comience recogiendo los gusanos de su césped bacteriano en una placa de medio de crecimiento de nematodos frescos sin semillas y permitiendo que los gusanos se muevan por el plato durante cinco minutos. Mientras los gusanos se aclimatan, en una campana libre de RNasa, mezcle 10 microlitros de tampón de lisis con uno a 100 Dnase I por muestra y coloque la tapa de una tira de PCR boca abajo en la plataforma de un endoscopio de disección. A continuación, agregue 10 microlitros de la mezcla de lisis a las tapas de los tubos de PCR abovedados y saque los gusanos de la placa para evitar transferir bacterias a cada ranura de la tapa.Cuando se hayan transferido todos los gusanos, cierre las tapas y gire los tubos durante cinco segundos antes de colocarlos en un matraz Dewar de nitrógeno líquido. Después de los últimos cinco segundos, descongele los tubos en un baño de agua a 40 grados centígrados antes de repetir el procedimiento de congelación/descongelación nueve veces más. Después del último ciclo de congelación/descongelación, mezcle las muestras lisadas en un mezclador térmico durante 20 a 30 minutos a cuatro grados centígrados y aproximadamente 1800 revoluciones por minuto.Al final de la incubación de la mezcla, centrifugar las muestras como se demuestra y agregar un microlitro de solución de parada recién descongelada a cada tubo. Para la transcripción inversa de muestras calientes a granel, en una campana sin RNasa, prepare una mezcla maestra de tampón enzimático y agregue 14 microlitros de mezcla maestra a 11 microlitros de cada muestra. Pase las muestras a través de un termociclador utilizando el programa de transcripción inversa indicado y diluya el producto de ADNc resultante en una proporción de uno a cuatro en agua libre de nucleasas.Para la preamplificación de objetivos específicos, agregue 3,75 microlitros de mezcla maestra de preamplificación en un pocillo por muestra en una placa de 96 pocillos y agregue 1,25 microlitros de cada solución de ADNc a cada pocillo de mezcla maestra. Cuando se hayan cargado todas las muestras, cubra la placa con cinta de sellado y agite brevemente las muestras antes de girarlas por centrifugación, luego cargue la placa en un termociclador y ejecute el programa como se indica. Para eliminar los cebadores no incorporados de la preamplificación, al final del termociclo centrifuga la placa de muestra y retira con cuidado el sello.Agregue dos microlitros de mezcla maestra de exonucleasa I a cada reacción de preamplificación y vuelva a sellar, centrifugar y cargar la placa nuevamente en el termociclador. Al final del ciclo, diluir las muestras con 18 microlitros de tampón Tris-EDTA. Para configurar un chip de matriz múltiple, agregue 3,6 microlitros de mezcla maestra de carga de ensayo y 0,4 microlitros de cebador inverso delantero de 50 micromolares en un pocillo por muestra en una placa de 384 pocillos.A continuación, añada 2,2 microlitros de mezcla maestra de muestra y 1,8 microlitros de cada muestra tratada con exonucleasa I preamplificada en los pocillos apropiados de la placa. Para configurar un chip de matriz única, agregue 5,4 microlitros de la mezcla maestra de carga de ensayo y 0,6 microlitros del cebador inverso directo a un pocillo por muestra de una segunda placa de 384 pocillos, luego agregue 3,3 microlitros de mezcla maestra de muestra y 2,7 microlitros de cada muestra tratada con exonucleasa I preamplificada a los pocillos apropiados de la placa de matriz única preparada. Para preparar el chip nanofluídico para la primera ejecución, sosteniendo el chip en un ángulo de 45 grados, inyecte lenta y cuidadosamente 150 microlitros de fluido de línea de control en los acumuladores del chip.Cuando se haya cargado todo el fluido, retire la película protectora azul de la parte inferior del chip y colóquelo en la máquina de cebado de PCR de nanofluidics con el código de barras hacia afuera. A continuación, ejecute el script Prime(153x). Después del cebado, coloque el chip sobre una superficie oscura y, a medida que se cargue cada ensayo o una mezcla de muestra, retire los tapones de barrera correspondientes si es necesario y agregue el volumen adecuado de ensayo o mezcla de muestra a las entradas correspondientes del chip nanofluídico de acuerdo con el plan experimental.Después de cargar, coloque el chip en el termociclador nanofluídico y ejecute el protocolo apropiado en el software de recopilación de datos. Si no se utiliza todo el chip de matriz múltiple, realice una ejecución posterior a la secuencia de comandos para permitir el uso posterior de las matrices de chips restantes. Para probar si el protocolo de gusano a Ct es un método válido de extracción de ADNc, el método se comparó con los métodos estándar de extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidio.A nivel mundial, los niveles de expresión de ARNm de hsp-70 por 100 nanogramos de ARN total fueron comparables utilizando los métodos de fenol-cloroformo y de gusano a Ct. Sin embargo, en los casos de mayor expresión de hsp-70, la expresión fue mayor con el método de gusano a Ct, lo que indica una mejor sensibilidad. Para la extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidio de muestras a granel, hsp-70 disminuyó en un 82,7 % en los mutantes hsf-1 en comparación con los controles y en un 92,3% para el calentamiento a Ct, lo que indica que la disminución fue comparable entre los dos métodos.Utilizando ADNc obtenido de muestras masivas de 25 gusanos o de un promedio de 36 muestras de gusanos individuales, los métodos detectaron niveles de expresión comparables para todas las chaperonas analizadas, lo que indica que los parámetros obtenidos de gusanos individuales son confiables. Aquí, se muestra la expresión media de múltiples transcripciones de hsp de gusanos individuales después de un breve choque térmico. Como se ha observado, la variabilidad en la expresión de las transcripciones difiere drásticamente entre los diferentes genes.Para cada transcripción probada con muestras de gusanos individuales, los coeficientes técnicos de variabilidad fueron más bajos que los coeficientes biológicos de variabilidad, lo que indica que no se requirieron triplicados técnicos para la estimación de parámetros cuando se realizó qPCR en gusanos individuales. Al realizar este protocolo, es esencial pipetear pequeños volúmenes con precisión y no pipetear inverso en el chip nanofluídico. Este protocolo se puede utilizar para obtener grandes conjuntos de datos RT-qPCR, que luego se pueden exportar y procesar como se desee utilizando scripts de Excel o R.

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