RT-PCR cuantitativo de alto rendimiento en muestras de C. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica

Nuestro protocolo mejoró tanto el rendimiento como la eficiencia del tiempo para obtener datos de RT-qPCR directamente de una sola muestra o muestras pequeñas a granel sin necesidad de aislamiento de ARN. Con este protocolo, se pueden obtener más de 9.000 resultados de RT-qPCR en solo dos días de trabajo de laboratorio, un proceso que normalmente llevaría unas cinco semanas con la qPCR estándar de 96 pocillos. Este protocolo proporciona un ensayo RT-qPCR más rápido, robusto y altamente sensible en C. elegans, que es ideal para monitorear la variabilidad interindividual en la expresión génica entre gusanos isogénicos.

Comience recogiendo los gusanos de su césped bacteriano en una placa de medio de crecimiento de nematodos frescos sin semillas y permitiendo que los gusanos se muevan por el plato durante cinco minutos. Mientras los gusanos se aclimatan, en una campana libre de RNasa, mezcle 10 microlitros de tampón de lisis con uno a 100 Dnase I por muestra y coloque la tapa de una tira de PCR boca abajo en la plataforma de un endoscopio de disección. A continuación, agregue 10 microlitros de la mezcla de lisis a las tapas de los tubos de PCR abovedados y saque los gusanos de la placa para evitar transferir bacterias a cada ranura de la tapa.

Cuando se hayan transferido todos los gusanos, cierre las tapas y gire los tubos durante cinco segundos antes de colocarlos en un matraz Dewar de nitrógeno líquido. Después de los últimos cinco segundos, descongele los tubos en un baño de agua a 40 grados centígrados antes de repetir el procedimiento de congelación/descongelación nueve veces más. Después del último ciclo de congelación/descongelación, mezcle las muestras lisadas en un mezclador térmico durante 20 a 30 minutos a cuatro grados centígrados y aproximadamente 1800 revoluciones por minuto.

Al final de la incubación de la mezcla, centrifugar las muestras como se demuestra y agregar un microlitro de solución de parada recién descongelada a cada tubo. Para la transcripción inversa de muestras calientes a granel, en una campana sin RNasa, prepare una mezcla maestra de tampón enzimático y agregue 14 microlitros de mezcla maestra a 11 microlitros de cada muestra. Pase las muestras a través de un termociclador utilizando el programa de transcripción inversa indicado y diluya el producto de ADNc resultante en una proporción de uno a cuatro en agua libre de nucleasas.

Para la preamplificación de objetivos específicos, agregue 3,75 microlitros de mezcla maestra de preamplificación en un pocillo por muestra en una placa de 96 pocillos y agregue 1,25 microlitros de cada solución de ADNc a cada pocillo de mezcla maestra. Cuando se hayan cargado todas las muestras, cubra la placa con cinta de sellado y agite brevemente las muestras antes de girarlas por centrifugación, luego cargue la placa en un termociclador y ejecute el programa como se indica. Para eliminar los cebadores no incorporados de la preamplificación, al final del termociclo centrifuga la placa de muestra y retira con cuidado el sello.

Agregue dos microlitros de mezcla maestra de exonucleasa I a cada reacción de preamplificación y vuelva a sellar, centrifugar y cargar la placa nuevamente en el termociclador. Al final del ciclo, diluir las muestras con 18 microlitros de tampón Tris-EDTA. Para configurar un chip de matriz múltiple, agregue 3,6 microlitros de mezcla maestra de carga de ensayo y 0,4 microlitros de cebador inverso delantero de 50 micromolares en un pocillo por muestra en una placa de 384 pocillos.

A continuación, añada 2,2 microlitros de mezcla maestra de muestra y 1,8 microlitros de cada muestra tratada con exonucleasa I preamplificada en los pocillos apropiados de la placa. Para configurar un chip de matriz única, agregue 5,4 microlitros de la mezcla maestra de carga de ensayo y 0,6 microlitros del cebador inverso directo a un pocillo por muestra de una segunda placa de 384 pocillos, luego agregue 3,3 microlitros de mezcla maestra de muestra y 2,7 microlitros de cada muestra tratada con exonucleasa I preamplificada a los pocillos apropiados de la placa de matriz única preparada. Para preparar el chip nanofluídico para la primera ejecución, sosteniendo el chip en un ángulo de 45 grados, inyecte lenta y cuidadosamente 150 microlitros de fluido de línea de control en los acumuladores del chip.

Cuando se haya cargado todo el fluido, retire la película protectora azul de la parte inferior del chip y colóquelo en la máquina de cebado de PCR de nanofluidics con el código de barras hacia afuera. A continuación, ejecute el script Prime(153x). Después del cebado, coloque el chip sobre una superficie oscura y, a medida que se cargue cada ensayo o una mezcla de muestra, retire los tapones de barrera correspondientes si es necesario y agregue el volumen adecuado de ensayo o mezcla de muestra a las entradas correspondientes del chip nanofluídico de acuerdo con el plan experimental.

Después de cargar, coloque el chip en el termociclador nanofluídico y ejecute el protocolo apropiado en el software de recopilación de datos. Si no se utiliza todo el chip de matriz múltiple, realice una ejecución posterior a la secuencia de comandos para permitir el uso posterior de las matrices de chips restantes. Para probar si el protocolo de gusano a Ct es un método válido de extracción de ADNc, el método se comparó con los métodos estándar de extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidio.

A nivel mundial, los niveles de expresión de ARNm de hsp-70 por 100 nanogramos de ARN total fueron comparables utilizando los métodos de fenol-cloroformo y de gusano a Ct. Sin embargo, en los casos de mayor expresión de hsp-70, la expresión fue mayor con el método de gusano a Ct, lo que indica una mejor sensibilidad. Para la extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidio de muestras a granel, hsp-70 disminuyó en un 82,7 % en los mutantes hsf-1 en comparación con los controles y en un 92,3% para el calentamiento a Ct, lo que indica que la disminución fue comparable entre los dos métodos.

Utilizando ADNc obtenido de muestras masivas de 25 gusanos o de un promedio de 36 muestras de gusanos individuales, los métodos detectaron niveles de expresión comparables para todas las chaperonas analizadas, lo que indica que los parámetros obtenidos de gusanos individuales son confiables. Aquí, se muestra la expresión media de múltiples transcripciones de hsp de gusanos individuales después de un breve choque térmico. Como se ha observado, la variabilidad en la expresión de las transcripciones difiere drásticamente entre los diferentes genes.

Para cada transcripción probada con muestras de gusanos individuales, los coeficientes técnicos de variabilidad fueron más bajos que los coeficientes biológicos de variabilidad, lo que indica que no se requirieron triplicados técnicos para la estimación de parámetros cuando se realizó qPCR en gusanos individuales. Al realizar este protocolo, es esencial pipetear pequeños volúmenes con precisión y no pipetear inverso en el chip nanofluídico. Este protocolo se puede utilizar para obtener grandes conjuntos de datos RT-qPCR, que luego se pueden exportar y procesar como se desee utilizando scripts de Excel o R.