ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

מטרת הניסוי הבא היא לאפיין את ההרכב והפנוטיפ של לויקוציטים חודרים אבי העורקים והרפתקאות על ידי ציטומטריית זרימה. זה מושג על ידי בידוד אבי העורקים טרשת עורקים כשלב שני. האדוונטיציה שמסביב מבודדת מאבי העורקים ומכינים תרחיפי תאים בודדים משתי הרקמות.

לאחר מכן, מתקבלים תרחיפי התאים הבודדים של המסומנים באופן פלואורסצנטי כדי להבדיל בין תת-קבוצות ספציפיות של לויקוציטים מרקמת הכניסה ודופן אבי העורקים המראים את מגוון הלויקוציטים החודרים לאבי העורקים במהלך אטרוגנזה ואת ההיתכנות של בידוד לויקוציטים של רקמת אבי העורקים בהתבסס על ניתוח זרימה ציטומטרי של מתלי תאים בודדים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אימונוהיסטוכימיה הוא שניתן לבחון ולפנוטיפ לויקוציטים באמצעות סמנים מרובים מאבי העורקים היחיד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות למתווכים התאיים של דלקת בפתוגנזה של טרשת עורקים והפרעות דלקתיות אחרות בכלי הדם.

זיהוי לויקוציטים באבי העורקים ואפיון פנוטיפי של מתווכים קיימים וחדשים של דלקת יסייעו לאכול את מנגנוני טרשת העורקים. הנח צינור איסוף ריק לדם וצינור איסוף המכיל PBS על קרח. כדי לאסוף כל אבי העורקים, יש להשרות לזמן קצר עכבר שעבר המתת חסד עם אתנול 70% ולהדק את העכבר לשלב דיסקציה באמצעות סרט מעבדה.

לאחר מכן באמצעות מזרק הפריניזציה, שאבו דם מהעכבר באמצעות ניקוב לב. פתח את חללי הבטן והחזה בעזרת מספריים לניתוח באמצעות מזרק של 10 מיליליטר עם מחט בגודל 25 לחלחל לחלוטין את כלי הדם עם PBS המכיל 2% הפרין. לאחר מכן, נתח והסר את איברי הקרביים, איברי השתן באברי המין, הסרעפת והטחול, והשאיר את לב הכליה ואבי העורקים שלמים.

ודא שאין דם בתוך רקמות אבי העורקים. נתח בזהירות את רקמות השומן ובלוטות הלימפה הפרה-אבי העורקים הרחק מאבי העורקים, והשאיר את אבי העורקים והאדוונטיטיה שלמים. לאחר מכן אסוף את כל אבי העורקים, כולל קשת אבי העורקים וחלקי בית החזה והבטן היורדים.

הנח את אבי העורקים המבודד בצינור איסוף עם PBS. הסר את ה-PBS מצינור האיסוף המכיל את אבי העורקים. הוסף 2.5 מיליליטר של תמיסת אנזים עיכול חד פעמית של אבי העורקים אדוונטיטיה לאבי העורקים.

לאחר מכן דגרו את אבי העורקים עם תמיסת האנזים למשך 10 עד 20 דקות. ב-37 מעלות צלזיוס. הוסף PBS לצלחת פטרי במהלך הדגירה.

לאחר הדגירה. העבירו את אבי העורקים המעוכל חלקית מתמיסת האנזים לצלחת הפטרי עם ה-PBS בזהירות רבה. בעזרת שני זוגות מלקחיים מעוקלים, קלף את שכבת רקמת הכניסה הרחק מאבי העורקים כיחידה אחת.

כאשר האדוונטיציה הוסרה לחלוטין, העבירו את האדוונטיציה ואת אבי העורקים לצינורות פקס נפרדים. לאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר של תמיסת אנזים דיסוציאציה חד פעמית של אבי העורקים לאבי העורקים והאדוונטיטיה. ניתן לחתוך את אבי העורקים לחתיכות קטנות יותר.

כדי להקל על העיכול האנזימטי, דגרו על אבי העורקים והאדוונטיציה למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הזו, הניחו את אבי העורקים וצינורות הרקמה על קרח. הכן תרחיפי תאים בודדים מאבי העורקים והאדוונטיטיה באמצעות מסנני תאים של 70 מיקרון ובוכני מזרק כדי לגזור את הרקמה שנותרה.

העבר את מתלי התאים לחמישה צינורות פקס מפוליפרופילן מיליליטר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך חמש דקות בכוח הכבידה פי 400 בארבע מעלות צלזיוס. ריס כופף את התאים במיליליטר אחד של מאגר פקס והשתמש בכחול טריאן ובציטומטר המו כדי לספור את התאים.

מכיוון שהטיפול באנזים עשוי להשפיע על ביטוי אנטיגנים על פני השטח. דגרו חתיכות קטנות של טחול עם או בלי קוקטייל האנזים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר שעה. אשר את חוסר ההשפעה על ביטוי האנטיגן הניסיוני על ידי ציטומטריית זרימה.

סמן מספר מתאים של שפופרות פקס ניסיוניות ובקרות חדשות. הוסף את קוקטיילי הנוגדנים הניסיוניים והבקרה עבור האנטיגנים החוץ-תאיים הרצויים בקבוצה נפרדת של צינורות מסומנים. הניחו את צינורות הקוקטייל על קרח וכסו אותם כדי להגן על הפלואורופורים מפני אור.

לאחר מכן, העבירו כמות של חמש עד שמונה פעמים 10 לחמשת תאי אבי העורקים והאדוונטיס לתוך צינורות הפקס המתאימים המסומנים מראש. הוסף מיליליטר אחד של מאגר פקס לכל צינור וגלול את התאים באמצעות צנטריפוגה. הסר את הסופאן נטנט מהתאים הגלולים על ידי סילוק כדי להבחין בין תאים חיים ומתים.

ניתן להשתמש תחילה בערכת כתמי תאים מתים חיים הניתנת לתיקון, ליצור תמיסה חד פעמית של מת חי על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של צבע מת חי מומס מחדש במיליליטר אחד של PBS ומערבולת לערבוב. לאחר מכן, הוסף 100 עד 200 מיקרוליטר של צבע מת חי חד פעמי לצינורות הדגימה הניסיוניים והבקרה. לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורת חדר הדיאטה למשך 10 דקות בחושך.

דגרו על צינור הבקרה היחיד למתים חיים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס בחושך למשך 10 דקות כדי להרוג את התאים על ידי הלם חום. לאחר הדגירה יש לשטוף את כל התאים במיליליטר אחד של PBS ולגלול את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר פקס לכל צינור.

מערבולת הצינורות כדי לערבב אותם ואז כדור התאים על ידי צנטריפוגה. הסר את הסופינט מהתאים על ידי סילוק. הוסף 100 מיקרוליטר של בלוקין FC.

חוצץ פקס לכל הצינורות ומערבל בעדינות את הצינורות כדי להשעות מחדש את התאים. דגרו את הדגימות למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, שטפו את התאים כמו קודם.

הסר את ה-SUP natum מהתאים על ידי סילוק. הוסף 100 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המתאים לצינורות המתאימים לו. מערבולת בעדינות כדי להחייאה.

השעו את הגלולה ודגרו על כל הצינורות למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך לאחר הכתם החוץ-תאי של 20 עד 30 דקות. שטפו את התאים פעמיים כמו קודם, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים הגלולים ב-300 מיקרוליטר של 2% פרה-פורמלדהיד הפעל את הדגימות על צביעת ציטומטר זרימה. ה-TER 19 מדגים כי כלי דם מעוכלים שאינם מזרימים דם היקפי הם המקור לרוב הלויקוציטים שנותחו בתרחיף תאי אבי העורקים.

TER 1 1 9 תאי דם אדומים חיוביים מהווים 18% מהתאים בתרחיף תאי אבי העורקים המייצג הזה. זה מצביע על כך שפחות מ-0.02% מהתאים שבודדו מתרחיף תאי אבי העורקים של הדם נבעו מההשפעות של קוקטייל האנזים דיסוציאציה של אבי העורקים על אנטיגנים על פני הציטים. לקוקטייל האנזים אין השפעה על הביטוי של CD 45 או CD 19 כפי שניתן לראות כאן, כמו גם CD שלוש TCR, אלפא בטא TCR גמא דלתא ועוד כמה אנטיגנים על פני השטח שאינם מוצגים באיור זה.

באיורים הבאים, לויקוציטים חיוביים של אבי העורקים החי CD 45 היו מגודרים כדי לקבוע את אחוז תאי ה-T החיוביים לאינטרפרון גמא בתוך אבי העורקים של שני עכברים צעירים עם מחסור בליפופרוטאין APO. כאן, פרופילי הפיזור הקדמיים והפנימיים של אבי העורקים מייצג APOE מוצגים כמנתחים, רק אנטיגן הלויקוציטים הנפוץ CD 45 שימש להליכה על לויקוציטים אבי העורקים כפי שניתן לראות כאן. האוכלוסייה הגרגירית הקטנה לאורך ציר הפיזור הצדדי בפרופיל הפיזור הקדמי והצידי של הלויקוציטים של אבי העורקים הנראית באיור זה מרמזת על כך שתאים נמקיים בהליכת הלויקוציטים שלנו כדי להסיר את התאים הללו אקווה מתים חיים שימשו לשער על לויקוציטים ברי קיימא, שהיוו עד 30% מהאוכלוסייה המייצגת הנראית כאן באיור זה.

נוכחותם של תאים קטנים שאינם גרגירים בפרופיל הפיזור החי המת החי החיובי ל-CD 45 מצביעה על כך ששברי תאים עדיין קיימים בהליכה השלילית החיובית ל-CD 45. שער פיזור צד קדמי מצולע צויר כדי לכלול רק את התאים הגדולים יותר בניתוח כפי שניתן לראות כאן. בחינה של אוכלוסיית פיזור צד קדמי שלילי חיובי CD 45 עבור TCR אלפא בטא ואינטרפרון גמא מגלה כי 6% מהלויקוציטים החיים באבי העורקים הם תאי TCR אלפא בטא חיוביים לאינטרפרון גמא חיובי T עוזר אחד באמצעות סכימת שער דומה כמו בסדרת האיורים הקודמת, נתוני צביעה תוך תאיים מייצגים עבור CD 68 חיובי CD 11 B מקרופאגים חיוביים ואינטרפרון גמא חיוביים TCR אלפא בטא חיוביים מ ניתן לראות שני עכברים אפסים שהזינו דיאטה מערבית במשך 12 שבועות בנתונים הבאים כצפוי כפי שניתן לראות באיור זה.

אבי העורקים של תזונה מערבית ניזון מעכבר אפס APOE. רוב הלויקוציטים באבי העורקים הם מקרופאגים עם 40% CD 68 ו-CD 11 B חיוביים כפולים. תאים מיאלואידים חיוביים אחרים ל-CD 11 B מייצגים 15% מאוכלוסיית הלויקוציטים באבי העורקים בתוך הטחול של אותה תזונה מערבית המוזנת בעכבר אפס APOE.

7% מציטי ה-SP הקיימים היו CD 11 B חיובי CD 68 מקרופאגים חיוביים ו-10% היו תאים מיאלואידים חיוביים אחרים CD 11 B. לעומת זאת, באיור זה של דגימת בקרת איזוטיפ מייצגת, מוכתמת באופן דומה, רק 0.01% מציטי האפס של APOE הם חיוביים כוזבים עבור האיזוטיפ. בנוסף, תוך 12 שבועות בתזונה המערבית ניזונו עכברי APOE null, TCR alpha, תאי T מסייעים שליליים של אינטרפרון גמא חיובי בטא ותאי TH 1 המייצרים אינטרפרון גמא מהווים חלק עיקרי מאוכלוסיות תאי T חודרים והטחול.

כפי שניתן לראות בבדיקת איור זה של aov, אף ציט צבוע בבקרת איזוטיפ מצביע על כך שרק 0.5% מהתאים החיוביים לאינטרפרון גמא חיוביים ל-TCR אלפא בטא חיוביים באופן שגוי עבור אינטרפרון גמא כדי להדגים את ההיתכנות של בידוד אדוונטיציה אבי העורקים לצביעה ציטומטרית זרימה כאן, מוצג צביעת לויקוציטים חיוביים מייצגים CD 45 עבור מתלי תאי אבי העורקים והרקמה. לויקוציטים חיוביים CD 45 חודרים ייצגו כ-18% מתרחיף התא האדוונטיציאלי ו-11% מתרחיף תאי אבי העורקים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הריאגנטים הללו ואת התאים על קרח ובחושך, אלא אם כן צוין אחרת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהכין תרחיפי תאים בודדים מאבי העורקים והרפתקאות אבי העורקים או להשתמש בניסויי זרימה ציטומטרית.