De proteínas de membrana de superposición de ensayo: Un protocolo de prueba de interacción entre las proteínas soluble e insoluble In vitro

Proteína de prueba. La interacción de las proteínas es indispensable para la disección de la funcionalidad de las proteínas. Este video presenta un ensayo de unión a proteínas in vitro para probar la interacción entre una membrana y una proteína inmovilizada con una proteína soluble.

En primer lugar, se clonan, expresan y extraen las proteínas de fusión. La proteína insoluble marcada se inmoviliza en la membrana de nitrocelulosa y se trata para volver a plegarla a su confirmación nativa. A continuación, se sondea la membrana con proteínas solubles marcadas y se realiza una inmunotransferencia para detectar las proteínas.

Si las proteínas marcadas interactúan, son capturadas por la proteína inmovilizada en la membrana y se observará la señal de la inmunotransferencia. Por lo tanto, este ensayo proporciona un método confiable para probar la interacción entre una proteína insoluble y una proteína en solución. La principal ventaja de esta técnica sobre los vasos existentes, como el GST pull down, es que se puede evaluar de forma fiable la unión entre la proteína insoluble y la proteína soluble in vitro.

El primer paso de este procedimiento es generar proteínas marcadas genéticamente para su detección. Comience por clonar la proteína que se inmovilizará en la membrana. Refiérase aquí como pro Im para la proteína inmovilizada en un vector de expresión, que codifica una etiqueta grande como GST, el vector de expresión vacío, que codifica solo para la etiqueta se utilizará como un control negativo de proteína inmovilizada, y se conoce como pro IM nc.

A continuación, clona la proteína que se utilizará como sonda soluble en un vector de expresión, codificando una etiqueta diferente, como estreptococo dos. Esto se denominará prosol para la proteína soluble como un control negativo, clon, una proteína soluble de control negativo en el mismo vector de expresión. Esto se denominará Prosol NC para el control de proteínas solubles negativas.

A continuación, utilice un sistema de expresión de proteínas como un coli o un virus balo para expresar las proteínas marcadas, el sistema de expresión utilizado debe elegirse cuidadosamente en función de los requisitos de modificaciones postraduccionales. Extraer las proteínas expresadas del organismo de su elección. Para pro IM y pro I mnc Resus.

Suspenda las células en el tampón de carga de página SDS que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa. Luego hierva las células durante cinco minutos, luego centrifurícelas para eliminar el precipitado y extraer Prosol y prosol NC. Utilice procedimientos estándar. El pro IMS se puede extraer en condiciones de desnaturalización porque las proteínas se volverán a plegar después de ser inmovilizadas en la membrana de nitrocelulosa.

Sin embargo, los prosol deben extraerse para dar una confirmación nativa porque se agregarán al tampón de unión una vez que se hayan extraído las proteínas marcadas. Determine la concentración de las proteínas recombinantes utilizando un método estándar como el kit de ensayo de proteínas BioRad. Si se utiliza extracto crudo en lugar de proteína purificada para el ensayo.

Estimación de la concentración de la proteína de interés mediante densitometría de barrido de la banda correspondiente en un gel de poliacrilamida SDS teñido con kumasi. Utilizando concentraciones conocidas de BSA como referencia. A continuación, trace la curva estándar en función de las intensidades de señal medidas por la densitometría de barrido del BSA y calcule la cantidad de proteína contenida en el extracto bruto.

El siguiente paso del procedimiento es inmovilizar pro Iam y pro IAM NC en la membrana. Comience cargando un microgramo, cada uno de los extractos pro Iam y pro IAM NC por duplicado en un gel de poliacrilamida SDS. Después de la electroforesis, retire el gel de las placas de vidrio y colóquelo en 100 mililitros de tampón de transferencia, luego incube con agitación suave durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, realice una transferencia de Western para transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa después de la transferencia para permitir que las proteínas unidas a la membrana se replieguen. Coloque la membrana en 15 mililitros de tampón A e incube con una agitación suave. Para eliminar las FDS residuales, incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave.

Después de la incubación, retire con cuidado la membrana del tampón. Luego coloque la membrana en 25 mililitros de tampón de desnaturalización. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente con una agitación suave.

Durante la incubación, la membrana de nitrocelulosa se volverá opaca. A continuación, con unas pinzas, transfiera la membrana a 25 mililitros de TBS e incube con una suave agitación durante cinco minutos. Durante este paso, la membrana vuelve a su color blanco original.

A continuación, transfiera la membrana a 25 mililitros de tampón aglutinante. Incubar a cuatro grados centígrados con una agitación suave durante toda la noche. A continuación, la proteína soluble se utilizará para sondear la membrana en busca de la proteína inmovilizada.

Primero, prepare los tampones de hibridación y diluya de uno a 10 microgramos de prosol y prosol NC en tubos separados que contengan 10 mililitros de tampón aglutinante fresco. A continuación, transfiera el tampón a una bolsa de hibridación. A continuación, corte la membrana en dos tiras, ambas conteniendo pro IM y pro IAM nc.

Estas membranas se colocarán en el tampón de hibridación. Transfiera cada membrana a la solución de hibridación prosol o prosol NC e incube durante 1,5 horas a temperatura ambiente con una agitación suave. Retire las membranas de las soluciones de hibridación y enjuague tres veces durante 15 minutos en TBS.

Para visualizar las interacciones proteína-proteína, bloquee la membrana con leche desnatada al 2,5% en TBST durante una hora. Después de la incubación, coloque las membranas bloqueadas en la solución de anticuerpos primarios. En este caso, se utiliza el anticuerpo policlonal de conejo antiestreptococo dos.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave después de la incubación. Enjuague las membranas en 20 mililitros de TBST durante 15 minutos y dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, coloque las membranas en la solución de anticuerpos secundarios conjugados con HRP Aquí, se utiliza un anticuerpo IgG anti conejo conjugado con HRP.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave. Enjuague las membranas en 20 mililitros de TBST durante 15 minutos y dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente con una agitación suave como antes, después del enjuague final en TBS, visualice la interacción proteína-proteína utilizando un sustrato quimioluminiscente HRP Here Millipore. Im Molan Quimioluminiscencia Occidental.

El sustrato HRP se utiliza después de la inmunotransferencia del prosol. Enjuague la membrana y el TBST durante 15 minutos y dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a sondear las membranas con el anticuerpo primario para que la etiqueta se pro.

A continuación, se administra el anticuerpo secundario adecuado. Visualice PRO I y pro Im NNC mediante la detección de quimioluminiscencia para validar la identidad de las bandas obtenidas en el ensayo de superposición de membrana proteica. La interacción entre las proteínas A y K y YFP y MP CYFP se evaluó en células epidérmicas de tabaco utilizando el método descrito en este video, como se muestra aquí.

Cuando se evaluó la complementación de fluorescencia biomolecular, se reconstruyó la señal fuerte de YFP. Esta señal de BFC se acumula en Punta en la periferia celular, que son diagnósticas de plasma porque MP es una proteína altamente insoluble. Cuando se expresa en bacterias o en plantas, se adoptó el ensayo de superposición de membranas proteicas para validar esta interacción.

Los extractos de proteínas in vitro que contenían un microgramo de GST MP o GST no fusionado se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS seguida de electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa. Cuando estos productos se sondearon con un estreptococo dos GST mp soluble, pero no sin fusionar, GST exhibió unión. Además, cuando se probó el mismo conjunto de pro IMS con un estreptococo marcado con NADH quinasa 2 no relacionado con la quinasa pro saw nc IE, no se observó ninguna unión, lo que demuestra la especificidad de la interacción A NK MP. Al intentar este procedimiento, es importante recordar rellenar las proteínas inmovilizadas correctamente siguiendo el protocolo presentado.