Purificación de afinidad de complementación bimolecular para aislar dos proteínas que interactúan

Para detectar y aislar un par de proteínas específicas que interactúan mediante purificación de afinidad de complementación bimolecular, agregue un par de plásmidos de complementación de fluorescencia bimolecular-mezcla de agente de transfección en una placa de cultivo que contenga células de mamíferos.

Un plásmido codifica una proteína que interactúa, la proteína de cebo, fusionada con un fragmento de proteína fluorescente reportera. El otro plásmido codifica para la otra proteína de unión, la proteína presa, fusionada con el fragmento complementario de la proteína fluorescente.

incubar. El agente de transfección facilita la absorción celular de plásmidos. Las células transfectadas con éxito expresan proteínas localizadas en la membrana celular.

Las interacciones de las proteínas cebo-presa acercan los fragmentos de proteínas fluorescentes. Esto hace que los fragmentos se fusionen y se vuelvan a plegar, formando la proteína fluorescente funcional, cuya fluorescencia se puede visualizar bajo un microscopio de fluorescencia.

Reemplace el medio con un tampón de lisis que contenga detergente no iónico para alterar las membranas celulares, liberando las proteínas de fusión. Recoja el lisado celular en un tubo. Centrífuga.

Transfiera el sobrenadante que contiene proteína de fusión a un tubo nuevo. Agregue perlas de agarosa conjugadas con el anticuerpo de dominio único dirigido a proteínas fluorescentes, nanocuerpo, que reconoce y se une a un epítopo tridimensional en la proteína fluorescente plegada.

centrífuga. Vuelva a suspender las perlas de agarosa unidas a proteínas de fusión en tampón. Caliente para disociar las proteínas de fusión de las perlas de agarosa. Realice SDS-PAGE para separar proteínas individuales, seguido de western blot con anticuerpos específicos para los fragmentos de proteínas fluorescentes.

Solo se detectan proteínas que interactúan marcadas con fragmentos fluorescentes, lo que confirma su aislamiento.

Primero, siembra HEK293T células en platos de 10 centímetros que contienen 10 mililitros de DMEM. Luego, diluya 2,5 microgramos de cada vector de complementación de fluorescencia bimolecular en 500 microlitros de tampón de transfección.

Agregue 10 microlitros del reactivo de transfección y agite la mezcla durante 10 segundos. Luego, centrifuga brevemente las muestras e incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, agregue la mezcla de transfección de ADN gota a gota al plato. Luego, incube las muestras durante 8 a 24 horas.

Prepare el tampón de lisis celular y el tampón de lisis celular suplementado como se describe en el protocolo de texto. Luego, lave las células con PBS helado dos veces. Aspire el PBS y agregue 1 mililitro de tampón de lisis celular suplementado helado.

A continuación, coloque el plato en hielo e incube durante cinco minutos. Luego, use un raspador de células para extraer las células y transferirlas a un tubo de microcentrífuga refrigerado. Centrifugar el tubo a 18.000 veces la gravedad durante cinco minutos a 4 grados centígrados para eliminar los restos celulares. Luego, transfiera el sobrenadante transparente a un tubo de microcentrífuga nuevo.

Lave un volumen apropiado de perlas de agarosa en 1 mililitro de PBS. Luego, centrifuga las perlas a 300 veces la gravedad y retira con cuidado el sobrenadante. A continuación, agregue 20 microlitros de perlas de agarosa a cada muestra e incube a 4 grados centígrados durante dos horas con rotación de extremo a extremo.

Centrifugar las perlas a 300 veces la gravedad y lavarlas en tampón de lisis celular tres veces. Luego, vuelva a suspender las perlas lavadas en 50 microlitros de tampón de muestra diluido. Finalmente, caliente las muestras a 95 grados centígrados durante dos o tres minutos.