Purificación de afinidad de complementación bimolecular para aislar dos proteínas que interactúan
JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:29 min • July 8th, 2025
Para detectar y aislar un par de proteínas específicas que interactúan mediante purificación de afinidad de complementación bimolecular, agregue un par de plásmidos de complementación de fluorescencia bimolecular-mezcla de agente de transfección en una placa de cultivo que contenga células de mamíferos.
Un plásmido codifica una proteína que interactúa, la proteína de cebo, fusionada con un fragmento de proteína fluorescente reportera. El otro plásmido codifica para la otra proteína de unión, la proteína presa, fusionada con el fragmento complementario de la proteína fluorescente.
incubar. El agente de transfección facilita la absorción celular de plásmidos. Las células transfectadas con éxito expresan proteínas localizadas en la membrana celular.
Las interacciones de las proteínas cebo-presa acercan los fragmentos de proteínas fluorescentes. Esto hace que los fragmentos se fusionen y se vuelvan a plegar, formando la proteína fluorescente funcional, cuya fluorescencia se puede visualizar bajo un microscopio de fluorescencia.
Reemplace el medio con un tampón de lisis que contenga detergente no iónico para alterar las membranas celulares, liberando las proteínas de fusión. Recoja el lisado celular en un tubo. Centrífuga.
Transfiera el sobrenadante que contiene proteína de fusión a un tubo nuevo. Agregue perlas de agarosa conjugadas con el anticuerpo de dominio único dirigido a proteínas fluorescentes, nanocuerpo, que reconoce y se une a un epítopo tridimensional en la proteína fluorescente plegada.
centrífuga. Vuelva a suspender las perlas de agarosa unidas a proteínas de fusión en tampón. Caliente para disociar las proteínas de fusión de las perlas de agarosa. Realice SDS-PAGE para separar proteínas individuales, seguido de western blot con anticuerpos específicos para los fragmentos de proteínas fluorescentes.
Solo se detectan proteínas que interactúan marcadas con fragmentos fluorescentes, lo que confirma su aislamiento.
Primero, siembra HEK293T células en platos de 10 centímetros que contienen 10 mililitros de DMEM. Luego, diluya 2,5 microgramos de cada vector de complementación de fluorescencia bimolecular en 500 microlitros de tampón de transfección.
Agregue 10 microlitros del reactivo de transfección y agite la mezcla durante 10 segundos. Luego, centrifuga brevemente las muestras e incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, agregue la mezcla de transfección de ADN gota a gota al plato. Luego, incube las muestras durante 8 a 24 horas.
Prepare el tampón de lisis celular y el tampón de lisis celular suplementado como se describe en el protocolo de texto. Luego, lave las células con PBS helado dos veces. Aspire el PBS y agregue 1 mililitro de tampón de lisis celular suplementado helado.
A continuación, coloque el plato en hielo e incube durante cinco minutos. Luego, use un raspador de células para extraer las células y transferirlas a un tubo de microcentrífuga refrigerado. Centrifugar el tubo a 18.000 veces la gravedad durante cinco minutos a 4 grados centígrados para eliminar los restos celulares. Luego, transfiera el sobrenadante transparente a un tubo de microcentrífuga nuevo.
Lave un volumen apropiado de perlas de agarosa en 1 mililitro de PBS. Luego, centrifuga las perlas a 300 veces la gravedad y retira con cuidado el sobrenadante. A continuación, agregue 20 microlitros de perlas de agarosa a cada muestra e incube a 4 grados centígrados durante dos horas con rotación de extremo a extremo.
Centrifugar las perlas a 300 veces la gravedad y lavarlas en tampón de lisis celular tres veces. Luego, vuelva a suspender las perlas lavadas en 50 microlitros de tampón de muestra diluido. Finalmente, caliente las muestras a 95 grados centígrados durante dos o tres minutos.
Descripción general
Este artículo describe un método para detectar y aislar proteínas interactivas específicas mediante purificación por afinidad basada en complementación bimolecular. La técnica consiste en transfectar células de mamífero con plásmidos que codifican proteínas carnada y presa fusionadas a fragmentos complementarios de proteínas fluorescentes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Interacciones de proteínas
Antecedentes
- La complementación bimolecular de fluorescencia permite la visualización de interacciones proteicas.
- Los fragmentos de proteínas fluorescentes pueden utilizarse para confirmar interacciones entre proteínas.
- Este método es aplicable en diversos contextos de investigación biológica.
- Comprender las interacciones proteicas es fundamental para elucidar los mecanismos celulares.
Objetivo del estudio
- Aislar y visualizar interacciones proteicas específicas en células de mamífero.
- Mostrar la eficacia de la complementación bimolecular en el estudio de la dinámica proteica.
- Proporcionar un protocolo detallado para que los investigadores puedan replicar el método.
Métodos Utilizados
- Transfección de células de mamífero con plásmidos de complementación bimolecular de fluorescencia.
- Uso de un agente de transfección para facilitar la incorporación del plásmido.
- Lisis celular y centrifugación para aislar las proteínas de fusión.
- Transferencia Western para detectar proteínas interaccionantes marcadas con fragmentos fluorescentes.
Resultados principales
- Expresión exitosa de fragmentos de proteínas fluorescentes en células transfectadas.
- Aislamiento de proteínas interactivas confirmado mediante inmunotransferencia (western blotting).
- Visualización de interacciones proteicas mediante microscopía de fluorescencia.
- Reproducibilidad del protocolo demostrada mediante múltiples ensayos.
Conclusiones
- La complementación bimolecular es un método eficaz para estudiar interacciones proteicas.
- Esta técnica puede adaptarse para diversas aplicaciones de investigación en biología celular.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para explorar redes complejas de proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
BiCAP permite el aislamiento directo de dímeros proteicos específicos a partir de lisados de células de mamífero, proporcionando una lectura funcional de interacciones binarias que apoya la validación de objetivos en las primeras etapas del descubrimiento. Al acoplar la complementación fluorescente bimolecular con la purificación por afinidad, el método genera complejos cuantificables para análisis posteriores, reduciendo los falsos positivos en la detección de interacciones. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en la selección de objetivos al confirmar la asociación física en condiciones casi nativas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de pares específicos de proteínas captora-objetivo a partir de lisados complejos.
- Valor operativo: Proporciona una confirmación bioquímica de la interacción que complementa las lecturas basadas en imágenes.
- Valor predictivo: Apoya la reducción del riesgo del blanco al validar la interacción física antes de los ensayos funcionales.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Genera complejos proteicos aislados adecuados para análisis cuantitativo mediante western blot o espectrometría de masas.
- Valor operativo: Utiliza la precipitación con perlas de agarosa estandarizada junto con nanocuerpos específicos de conformación para una captura reproducible.
- Preparación del ensayo: El producto es compatible con SDS-PAGE e inmunotransferencia, lo que permite un perfilado escalable de interacciones.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad traduccional: Los complejos aislados pueden analizarse para detectar modificaciones postraduccionales o la reclutación de cofactores relevantes para estados patológicos.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Confirma la interacción binaria en un sistema definido, reduciendo la ambigüedad en el mapeo de vías.
- Relevancia preclínica: Compatible con modelos celulares de mamíferos utilizados en la validación de dianas y en las cascadas de optimización de fármacos líderes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
BiCAP se sitúa entre la selección inicial de interacciones y la identificación de compuestos activos, ofreciendo un paso de validación bioquímica que conecta los flujos de trabajo de imagen y proteómica.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis de interacción binaria mediante el aislamiento únicamente de los pares de proteínas que inducen complementación fluorescente.
- Cribado: Genera complejos derivados de lisados susceptibles de detección cuantitativa, lo que permite la confirmación de resultados positivos en ensayos de interacción.
- Análisis: Permite la cuantificación mediante inmunotransferencia de proteínas captoras y diana aisladas, proporcionando una métrica de interacción semicuantitativa.
- Investigación Traducional: Los complejos aislados pueden analizarse para detectar modificaciones relevantes para enfermedades cuando se utilizan células patógenas o modelos celulares de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Los reactivos de plásmidos y nanocuerpos son adaptables a distintos pares de proteínas, lo que facilita su implementación en formato de plataforma para la validación de interacciones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al aislar únicamente los complejos complementados de forma fluorescente que interactúan.
- Valor operativo: Emplea pasos estandarizados de lisis, unión y elución compatibles con la infraestructura existente de purificación por afinidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar al proporcionar evidencia bioquímica de interacción, reduciendo el riesgo de perseguir objetivos falsos positivos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de objetivos con interacción física validada, mejorando la eficiencia en las cascadas de identificación de candidatos iniciales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en clonación molecular para generar constructos de fusión de cebo y presa con fragmentos fluorescentes compatibles.
- Depende del acceso a microscopía de fluorescencia para la confirmación inicial de interacciones antes de la purificación.
- Necesita estandarización de la eficiencia de transfección y de los niveles de expresión en los vectores de cebo y presa para permitir comparaciones cuantitativas.
- La adaptación a sistemas modelo alternativos puede requerir optimización de las condiciones de lisis y compatibilidad del acoplamiento de nanocuerpos.
- Limitación práctica: solo detecta interacciones que induzcan el plegamiento correcto y la complementación de los fragmentos de la proteína fluorescente.
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Última actualización: 22 agosto 2026