Modelado del cáncer de próstata en modelos de ratón modificados genéticamente: una técnica de edición de genes localizados mediada por CRISPR/Cas9 en células del lóbulo anterior de la próstata de ratón

Comience con un modelo de ratón knock-in CRISPR / Cas9 anestesiado y preparado con un genoma diseñado para expresar endonucleasas Cas9 y proteínas fluorescentes verdes, o GFP, por un fuerte promotor ascendente. Un casete floxed-STOP o LSL insertado inmediatamente aguas abajo del promotor bloquea la transcripción de Cas9 y GFP en condiciones normales.

Haga una incisión en la pared abdominal del ratón para exponer su lóbulo prostático anterior unido a la vesícula seminal. Inyecte la suspensión adenoviral deseada en el lóbulo anterior para facilitar la administración del genoma viral dirigido a las células. Vuelva a colocar el lóbulo de la próstata en la cavidad abdominal y suture la incisión.

Dentro de las células infectadas por virus, el genoma viral expresa enzimas recombinasas Cre y ARN guía dirigidos al gen que se va a mutar. Las enzimas Cre reconocen el casete LSL y extirpan el bloqueador de transcripción floxado. Este paso permite al promotor impulsar la expresión de endonucleasas Cas9 y GFP.

Posteriormente, las endonucleasas Cas9 forman complejos con ARN guía codificados por virus que dirigen estos complejos a la secuencia diana dentro del gen que se va a mutar. Esta localización permite que la endonucleasa Cas9 escinda el ADN genómico dentro del gen diana, lo que lleva a una alteración genética.

Una alteración oncogénica hace que las células mutadas se vuelvan cancerosas. La coexpresión de proteínas reporteras de GFP dentro de las células mutadas facilita la identificación y el seguimiento de la progresión del cáncer.

Para administrar el virus a la próstata, después de anestesiar a un ratón macho de 8 semanas de edad de acuerdo con el protocolo de texto, examine la profundidad de la anestesia evaluando la relajación muscular, la retirada del pedal y los reflejos palpebrales. Cuando se observe pérdida de reflejos, afeitar la parte inferior del abdomen del animal. Con un hisopo de algodón estéril, cubra cuidadosamente los ojos del animal con ungüento oftálmico veterinario para evitar la ceguera causada por la xeroftalmia. Luego, use etanol al 70% y povidona yodada al 10% para limpiar el abdomen afeitado y desinfectar el área quirúrgica.

A continuación, con unas tijeras quirúrgicas estériles, haga una incisión cutánea vertical de aproximadamente 1 centímetro en la línea media abdominal baja. Luego, con unas pinzas de punta fina, levante el peritoneo para evitar dañar los órganos que se encuentran debajo y use tijeras quirúrgicas para hacer con cuidado una incisión de 8 milímetros o menos a través del peritoneo. Mueva suavemente el tejido graso a un lado para descubrir la vesícula seminal. Luego, con una pinza anillada, levante con cuidado la vesícula seminal hasta que se pueda identificar la próstata anterior.

Ahora, con una jeringa de insulina de 0,5 mililitros y una aguja de 30G x 8 milímetros, inyecte un volumen total de 30 microlitros de solución de virus en el epitelio prostático anterior. Minimice las fugas y asegúrese de que el líquido se absorba dentro del tejido, formando una pequeña burbuja. Luego, vuelva a colocar la vesícula seminal en la cavidad abdominal.

Para asegurarse de que el líquido se absorba dentro del tejido en una pequeña burbuja y sin fugas, asegúrese de inyectar paralelo a la vesícula seminal y siguiendo la forma del lóbulo prostático anterior.

Con una aguja de punta cónica y un círculo de 13 milímetros y 3/8, sutura el peritoneo con dos o tres puntos interrumpidos simples de sutura absorbible 6-0. Luego, levantando la piel con fórceps para evitar dañar el peritoneo, engrapa la piel con tres clips estériles de 4,8 x 6,5 milímetros.

Para una mejor recuperación después de la cirugía, use una jeringa estéril de 1 mililitro y una aguja de 27G x 1/2 pulgada para administrar el antídoto anestésico en una dosis de 0.1 mililitros por gramo de peso corporal mediante inyección intraperitoneal. Luego, vuelva a colocar con cuidado al animal en su jaula.