Inmunotinción con oro de secciones exosómicas: una técnica para visualizar marcadores de diagnóstico en la luz exosomal

Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares que encierran una variedad de biomoléculas que sirven como biomarcadores del cáncer.

Para visualizar biomarcadores exosómicos, comience con secciones exosomales ultrafinas incrustadas en resina apoyadas en rejillas metálicas de microscopía electrónica adecuadas. Incube las rejillas en gotas de glicina. La glicina se une y neutraliza los grupos aldehídos reactivos en las secciones para superar su interferencia con el ensayo.

Enjuague la muestra con agua para eliminar los reactivos residuales. Posteriormente, incube la muestra en un tampón de bloqueo. El tampón transporta proteínas séricas que bloquean los sitios de unión de anticuerpos no específicos en la muestra.

A continuación, incube la muestra en la solución de anticuerpos primarios deseada. Estos anticuerpos reconocen y se unen a sus biomarcadores diana localizados en la luz exosómica. Lave los anticuerpos no unidos con un tampón adecuado.

Ahora, transfiera las rejillas que contienen muestras a gotas que contengan anticuerpos secundarios conjugados con oro que se adhieran a los anticuerpos primarios. Las nanopartículas de oro sirven como marcadores densos en electrones para visualizar la localización fina de las moléculas objetivo. Lave los anticuerpos secundarios no unidos con un tampón adecuado.

Finalmente, en condiciones de oscuridad, incube las rejillas secuencialmente en soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo. Estos reactivos de metales pesados tiñen y mejoran el contraste de moléculas orgánicas como lípidos, proteínas y glucógenos en la muestra, diferenciándolos del fondo.

Observe las secciones teñidas bajo un microscopio electrónico de transmisión. Los biomarcadores marcados con oro aparecen como partículas oscuras dentro del lumen de las estructuras de exosomas teñidas de metales pesados.

Para comenzar, incube rejillas que contengan secciones sin teñir de 60 nanómetros de espesor en gotas de 50 microlitros de glicina 0,02 M durante 10 minutos para apagar los grupos aldehídos libres. Luego, enjuague las secciones en 100 microlitros de agua destilada tres veces durante 10 minutos cada una. Después del último enjuague, incube las secciones durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS que contenga BSA al 1%. Luego, incube las rejillas en gotas de 50 a 100 microlitros de un anticuerpo anti-KRS durante 1 hora.

A continuación, lave las rejillas cinco veces durante 10 minutos cada una en una gota de PBS que contenga 0.1% de BSA. Luego, transfiera las rejillas a una gota de un anticuerpo secundario apropiado e incube las secciones durante 1 hora a temperatura ambiente. Ahora, lave las rejillas cinco veces durante 10 minutos cada una con una gota separada de PBS que contenga 0.1% de BSA. Tiña dos veces las secciones con acetato de uranilo al 2% durante 20 minutos en la oscuridad, seguido de citrato de plomo de Reynold durante 10 minutos. Coloque la sección teñida en un microscopio electrónico de transmisión y vea la muestra usando 80 kV y obtenga imágenes de ellas usando el software del microscopio.

• Exosomes - Small extracellular vesicles enclosing cancer biomarkers.
• Glycine - A compound used to bind and neutralize reactive aldehyde groups.
• Blocking Buffer - A solution containing serum proteins that block non-specific antibody binding sites.
• Primary Antibody - A protein that recognizes and binds to target biomarkers in the exosomal lumen.
• Secondary Antibodies - Proteins tagged with gold-nanoparticles used to visualize primary antibodies.

• Introduce Exosomes - Definition and importance in cancer diagnosis (e.g., exosomes).
• Outline Glycine's Role - Its function in stabilizing exosomal structures (e.g., glycine).
• Explain Blocking Buffer - Serum proteins preventing unwanted reactions (e.g., blocking buffer).
• Educate on Antibody Tagging - Importance in visualizing exosomal biomarkers.

• What are exosomes and how do they serve as cancer biomarkers?
• What is the role of glycine in visualizing exosomal biomarkers?
• Why is a blocking buffer used in this process?

• Practical Application - Exosomes as diagnostic tools in cancer studies (e.g., exosome detection).
• Industry Impact - Enhancement of diagnostic accuracy in healthcare (e.g., cancer diagnostics).
• Societal Importance - Improving early detection and treatment strategies (e.g., personalized medicine).
• Scientific Advancements - Advancements in biomarker detection techniques.