Aislamiento de células mononucleares a partir de cerebro de ratón: una técnica de centrifugación de gradiente de densidad para aislar células mononucleares residentes en el cerebro

Las células mononucleares en el cerebro, que comprenden linfocitos y monocitos, juegan un papel crucial en el mantenimiento de la función cerebral y la homeostasis.

Para aislar estas células mononucleares, primero, tome un cerebro de ratón recién cosechado perfundido con solución salina.

La perfusión permite la eliminación de sangre y sus componentes de los vasos sanguíneos, lo que permite el aislamiento de las células inmunitarias residentes en el cerebro en los pasos posteriores.

Ahora, enjuague el cerebro con medios adecuados para eliminar los glóbulos rojos adheridos. Continúe el enjuague con picado para adquirir pequeños trozos de tejido.

Homogeneizar las piezas de tejido para obtener una suspensión de células individuales y fragmentos de células.

A esta suspensión, agregue medios enfriados y un medio de gradiente de densidad adecuado en volúmenes apropiados para formar un medio de gradiente de baja densidad.

A continuación, agregue un volumen específico de un medio de gradiente de alta densidad; el medio de gradiente de alta densidad forma una capa separada en la parte inferior, creando un gradiente de densidad discontinuo.

Centrifugar la suspensión a alta velocidad y baja temperatura. Las células mononucleares ocupan la interfaz entre las dos capas de medios de gradiente de densidad.

Deseche la capa superior que contiene desechos celulares y mielina, la vaina de tejido graso que rodea los axones de las células nerviosas.

Transfiera la capa de interfaz a un tubo nuevo que contenga un medio adecuado y centrífuga.

Las células mononucleares purificadas sedimentan como gránulos y pueden resuspenderse en tampón para su posterior análisis.

Corte el cráneo con cuidado desde la nariz hasta el cuello y transfiera el cerebro de cada animal de la caja craneal a tubos individuales de 50 mililitros que contengan 10 mililitros de medio RPMI.

Mezcle bien los tubos para eliminar los glóbulos rojos adherentes y elimine el medio por aspiración. Agregue 10 mililitros de medio fresco a cada tubo y transfiera los cerebros a platos individuales de 100 milímetros.

Pica finamente cada cerebro con una navaja de afeitar y usa una pipeta de plástico para transferir la mayor cantidad de tejido de un plato a la vez en 6 mililitros de medio a un homogeneizador de vidrio sinterizado helado de 7 mililitros.

Muele el cerebro usando el émbolo "suelto" del mortero antes de usar el émbolo "apretado" para llevar el tejido hasta que la suspensión sea homogénea. Luego, vierta la suspensión de tejido resultante en un tubo cónico de 15 mililitros preenfriado con hielo.

Cuando se hayan homogeneizado todas las muestras, ajuste el volumen en cada tubo a 7 mililitros con medio nuevo antes de agregar cada suspensión de tejido a un nuevo tubo enfriado de 15 mililitros que contenga 3 mililitros de matriz de membrana basal al 100% por tubo.

Mezcle por inversión varias veces y use una pipeta de 3 mililitros para agregar cuidadosa y lentamente 1 mililitro de solución de gradiente de densidad al 70% debajo de cada muestra de solución de tejido.

Separe las células mediante centrifugación por gradiente de densidad y elimine casi toda la capa superior, teniendo cuidado de eliminar completamente toda la mielina.

Transfiera la interfaz a un nuevo tubo de 15 mililitros y ajuste el volumen a 10 mililitros con medio nuevo. Luego, centrifuga las muestras nuevamente y retira el sobrenadante antes de volver a suspender los gránulos en aproximadamente 100 microlitros de medio por tubo.

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