Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad
February 16th, 2018
Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.
El objetivo general de este protocolo es aislar una población de microglía de alta pureza de roedores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroinformación, como la identificación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre en la microglía o la realización de ensayos de detección de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es el aislamiento de una población de microglía de alta pureza sin necesidad de un tiempo prolongado en cultivo.
Para comenzar este procedimiento, inserte las puntas de las tijeras a través de la abertura en el canal espinal y haga incisiones laterales en el canal auditivo. Luego, deslice suavemente el tejido hacia la tribuna para exponer el cráneo. A continuación, haz una incisión a lo largo de la sutura sagital hacia el bregma.
Luego, inserta la punta de las tijeras en el bregma y haz incisiones laterales. Después, retira suavemente el cráneo para exponer el cerebro. Con unas pinzas curvas, retírelo y transfiéralo a un recipiente estéril de cinco mililitros.
Lávelo dos o tres veces con cinco mililitros de medios de lavado helados por lavado para eliminar la sangre. En una campana de flujo de aire laminar, coloque el contenido del recipiente de cinco mililitros en una pequeña placa de Petri que descanse sobre hielo. Con una hoja de bisturí estéril o unas tijeras estériles, retire el cerebelo y el bulbo olfatorio.
Luego, haz un corte en la línea media para separar los dos hemisferios. Posteriormente, identificar la capa meníngea como una capa muy delgada de células con un tinte rojo en la superficie del cerebro con vasos sanguíneos visibles. Retire cuidadosamente la capa meníngea con pinzas finas, teniendo cuidado de no dañar las cortezas.
Si la capa meníngea se rompe, continúe pelando los fragmentos desgarrados hasta que se elimine por completo. Luego, transfiera los hemisferios a una nueva placa de Petri pequeña con hielo y llénela con medios de lavado. Pica el cerebro en trozos pequeños con una hoja de bisturí estéril.
A continuación, añada 100 microlitros de papaína y 150 microlitros de DNasa1 en el medio e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de la digestión, triture el tejido con una pipeta P1000. Si los trozos de tejido son demasiado grandes para entrar en la pipeta, considere la posibilidad de utilizar unas tijeras estériles para ensanchar la punta de la pipeta.
Durante este proceso, tenga cuidado de no introducir burbujas en el medio, ya que esto puede reducir la viabilidad celular. En una campana de flujo laminar, prepare un tubo cónico de 50 mililitros con un filtro de celdas de 100 micrómetros. Vierta el medio digestivo y las piezas de cerebro en el colador.
Empuje a través de las piezas de cerebro usando el émbolo de una jeringa estéril de tres mililitros con un movimiento de molienda hasta que no haya más tejido visible. Lave continuamente el filtro con los medios de lavado durante todo este proceso. Esto lavará a través de cualquier celda atrapada en el colador.
Después de eso, centrifugar la suspensión de una sola celda a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, prepare el Percoll isotónico en stock añadiendo una proporción de nueve a uno del medio de gradiente de densidad a un HBSS estéril 10X. Prepare gradientes como 30%SIP en DMEM y 70%SIP en un HBSS de X.
Por ejemplo, para preparar 10 mililitros de 30% de SIP, agregue tres mililitros de SIP a siete mililitros de DMEM. A continuación, aspire el sobrenadante del tubo cónico y vuelva a suspender el pellet de celda con ocho mililitros de 30%SIP en DMEM. Transfiera el volumen completo a un tubo cónico nuevo de 15 mililitros.
A continuación, subbase la solución 70%SIP llenando una pipeta de transferencia con 70%SIP y empuje con cuidado a través de la pipeta de transferencia hasta el fondo del tubo cónico. Una vez que la punta esté cerca del fondo, empuje suavemente el contenido a través de la pipeta de transferencia. A continuación, centrifugar las capas SIP, incluidas las celdas, a 650 G con freno cero y aceleración cuatro durante 25 minutos a temperatura ambiente.
La capa 70%Percoll debe cubrirse con mucho cuidado. La interrupción de esta interfaz puede afectar gravemente el atrapamiento de la microglía en la capa celular y reducir gravemente los rendimientos. A continuación, aspire cuatro mililitros del medio con residuos celulares desde la parte superior del tubo para facilitar la eliminación de las células mononucleares en el siguiente paso.
A continuación, baje con cuidado la punta de la pipeta hacia la interfaz y aísle las células mononucleares de la interfaz del medio con gradiente de densidad 30/70. Recoja aproximadamente tres mililitros de la interfaz turbia y transfiéralo a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Después de esto, diluya la mezcla con nueve mililitros de HBSS para ayudar a eliminar el medio de gradiente de densidad.
Centrifugar la interfaz del medio de gradiente de densidad diluida que contiene las células mononucleares a 500 G durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y volver a suspenderlo con un mililitro de medio de crecimiento. Posteriormente, tiñe las células resuspendidas con azul de tripán y realiza un recuento de células con un hemocitómetro.
En este paso, centrifugar las células mononucleares recolectadas a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar el medio de crecimiento, ya que esto interferirá con el aislamiento magnético. Utilizando el mismo recuento de células obtenido anteriormente, vuelva a suspender a una vez de 10 a las ocho células nucleadas por mililitro en PBS que contengan 2% de FBS y un milimolar de EDTA dentro de un rango de volumen de 0,1 a 2,5 mililitros. A continuación, agregue el volumen completo de células nucleadas en PBS a un tubo nuevo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros.
A continuación, añada 50 microlitros de reactivo de marcado CD11b PE por mililitro de muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz. Después de eso, agregue 70 microlitros de cóctel de selección por un mililitro de muestra.
Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos protegido de la luz. Posteriormente, mezcle las partículas magnéticas pipeteando hacia arriba y hacia abajo más de cinco veces. Añadir 50 microlitros por mililitro de a la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos protegido de la luz.
Si el volumen total de la mezcla de células es inferior a 2,5 mililitros, rellene hasta este volumen con PBS que contenga 2% de FBS y un milimolar de EDTA y mezcle pipeteando suavemente dos o tres veces. Luego, coloque el tubo en el imán e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. En un movimiento continuo, invierta completamente el imán que contiene el tubo durante dos o tres segundos para verter el sobrenadante.
Vuelva a colocar el imán en posición vertical y retire el tubo del imán. Después de eso, lave las celdas restantes de la columna repitiendo los procedimientos. Vuelva a suspender las células en el medio de crecimiento deseado.
Enjuague el costado del recipiente de recolección para recolectar células de los lados del tubo y maximizar los rendimientos. Como se puede ver en esta figura, la microglía primaria aislada conserva su cuerpo celular esférico y su estructura ramificada distintiva. Aquí están los gráficos representativos de la microglía aislada.
La tinción combinada de anexina V y yoduro de propidio permite la categorización de células apoptóticas, necróticas o vivas después de la estimulación con LPS. El medio condicionado con hAEC redujo significativamente la apoptosis de la microglía en relación con los controles, lo que sugiere una forma de protección en este tipo de células. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis a ocho horas si se realiza correctamente.
Al realizar este método, es importante tener mucho cuidado al colocar el Percoll en capas, ya que este paso tendrá el mayor impacto en los rendimientos. Siguiendo esta técnica, se pueden utilizar otros procedimientos, como el ensayo de función fagocítica o el cocultivo con neuronas, para responder preguntas adicionales sobre las propiedades inmunomoduladoras del tipo de célula de elección en la microglía primaria. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo descubrieran cómo se puede modular la microglía primaria en la lesión cerebral perinatal.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de la lesión cerebral perinatal, ya que permite la caracterización de un tipo de célula inmunitaria primaria que se sabe que está involucrada en la neuroinformación que conduce a la disfunción motora y cognitiva. Aunque este método puede proporcionar información sobre los trastornos motores como la parálisis cerebral, también se puede aplicar a otros trastornos en los que la microglía desempeña un papel en la patogénesis, como la enfermedad de Alzheimer. La idea de este método fue cuando quisimos una técnica para la caracterización rápida de la microglía que sorteara los posibles cambios epigenéticos después de un tiempo prolongado en cultivo.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar la población de microglía de alta pureza para la caracterización posterior.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo detallado para aislar microglía primaria de cerebros murinos, lo que mejora nuestra comprensión de las condiciones neurológicas. El método integra centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética para lograr muestras de microglía de alta pureza de manera eficiente. También se describen los pasos clave para la caracterización celular.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Antecedentes
- Las microglías juegan roles críticos en el sistema nervioso y su aislamiento es esencial para estudiar sus funciones.
- Este protocolo ayuda a abordar preguntas importantes sobre el comportamiento de la microglía y sus interacciones con otros tipos de células.
- La microglía de alta pureza es vital para obtener resultados experimentales precisos en la investigación neurológica.
- El protocolo minimiza la necesidad de tiempos de cultivo prolongados, facilitando el uso inmediato de células recién aisladas.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo robusto para el aislamiento de células microgliales puras de cerebros de roedores.
- Mejorar la comprensión del papel de la microglía en la neuroinflamación y otros trastornos neurológicos.
- Permitir aplicaciones posteriores como estudios de cribado de fármacos e inmunomodulación.
Métodos utilizados
- Aislamiento de tejido cerebral ex vivo seguido de digestión mecánica y enzimática.
- El modelo biológico consiste en cerebros murinos para el aislamiento de microglía.
- Los métodos incluyen centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética.
- Los pasos clave implican un cuidadoso manejo del tejido y condiciones de incubación específicas para garantizar una alta viabilidad celular.
- Se enfatizaron técnicas de alta precisión para aislar y caracterizar células a lo largo del protocolo.
Resultados principales
- El protocolo produce con éxito una población de microglía de alta pureza lista para el análisis.
- La microglía aislada puede usarse para varios ensayos, proporcionando información sobre sus propiedades funcionales y respuestas.
- El método permite un acceso rápido a células recién aisladas, crucial para necesidades experimentales inmediatas.
- Se destacó la robustez del protocolo, asegurando resultados reproducibles y confiables en diferentes experimentos.
Conclusiones
- Este estudio permite a los investigadores aislar fácilmente células microgliales, facilitando una comprensión más profunda de su papel en la salud y la enfermedad.
- Las técnicas descritas establecen una base para una mayor exploración de los procesos neuroinflamatorios y las terapias asociadas.
- Las ideas obtenidas de este método pueden avanzar el conocimiento sobre las funciones de la microglía y sus implicaciones en la investigación neurológica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Rapid isolation and characterization of primary mouse microglia enables high-fidelity modeling of neuroinflammatory mechanisms in early discovery and preclinical research. This protocol delivers high-purity microglial populations without extended culture, supporting robust target validation and functional screening in CNS drug discovery. The approach enhances predictive confidence for neuroimmune modulation strategies and accelerates translational insights into neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial activation states and polarization in disease-relevant contexts.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary cells for functional assays and pathway analysis.
- Facilitates rapid hypothesis testing on microglial responses to candidate therapeutics or environmental stimuli.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for quantitative in vitro assays, including drug screening and immunomodulation studies.
- Reduces variability and artifacts associated with prolonged culture, improving assay reproducibility and standardization.
- Enables scalable preparation of microglial samples for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neuroinflammation, perinatal brain injury, and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional and phenotypic characterization of microglia.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers and therapeutic modulation of microglial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-purity microglia for target validation, mechanistic studies, and functional screening.
- Discovery Biology: Delivers primary microglia for hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways and cell-type specific responses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and immunomodulatory profiling.
- Analytics: Enables robust measurement of cell viability, apoptosis, and functional phenotypes post-stimulation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for microglial isolation applicable across CNS research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and functional de-risking.
- Operational Value: Streamlines microglial preparation, reducing time and resource requirements for assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reproducible functional data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS programs targeting microglial modulation.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in tissue dissection, density gradient centrifugation, and magnetic cell separation.
- Demands access to specialized instrumentation for gradient preparation and cell sorting.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for different species or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to procedural precision, particularly during gradient layering and cell collection.
