Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

El objetivo general del siguiente experimento es integrar una construcción de ADN deseada en el cromosoma bacteriano en un locus predeterminado. Esto se logra mediante un protocolo de apareamiento que involucra cuatro cepas bacterianas modificadas. La cepa receptora tiene una secuencia de plataforma de aterrizaje que consta de un gen de resistencia a la micina y el gen de la e. coli beta glucuronidasa flanqueado por sitios ATP integrados en su cromosoma.

La cepa donante P JH one 10 porta un plásmido que contiene en los sitios B un gen de proteína fluorescente roja relleno y un gen de resistencia a antibióticos. La cepa donante PJC dos porta un plásmido que contiene la integrasa específica del sitio del fago C 31 de Streptomyces bajo el control del promotor LAC. La cuarta cepa MT 616 proporciona los genes de transferencia necesarios para la conjugación, la transferencia de plásmidos de célula a célula, da como resultado la creación de trans a través de las cepas receptoras.

Adquisición de los dos plásmidos necesarios para el intercambio de casetes mediado por integrasa. El intercambio del casete del donante del plásmido PJ H one 10 con los marcadores del casete de la plataforma de aterrizaje en el cromosoma da como resultado la pérdida de los marcadores de la plataforma de aterrizaje, SPR y UIDA y el mantenimiento del casete del donante RFP y GMR en el inmigrante trans resultante. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos como la recombinación homóloga es la facilidad y eficiencia del protocolo.

También es transferible a una amplia gama de bacterias. La cepa aceptora utilizada en este video es una cepa S milli latte dos días antes del procedimiento de apareamiento para crear integrinas trans, inocular de una sola colonia en cinco mililitros de medio TY con micina spect, incubar la cepa S milli a 30 grados Celsius durante dos días con agitación el día antes del procedimiento de apareamiento, inocular cada una de las siguientes cepas de E. coli en cinco mililitros de medio líquido LB suplementado con el antibiótico adecuado DH cinco alfa que contiene el plásmido de expresión de integrasa en medio con tetraciclina MT 616, el movilizador intermedia con cloranfenicol y DH cinco alfa que contiene el plásmido de casete donante en medio con gentamicina, incubar las tres cepas de E. Coli durante la noche a 37 grados centígrados con agitación constante para preparar las células para el procedimiento de apareamiento. Transfiera 1,5 mililitros de cada uno de los cuatro cultivos a un tubo y centrifugue a 17.000 veces G durante 30 segundos para recoger el gránulo de células, deseche los medios y vuelva a suspender cada gránulo de célula en un mililitro de cloruro de sodio estéril al 0,85% centrífuga los tubos nuevamente después de desechar el sobrenadante Resus suspenda cada pellet en 100 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,85% usando una pipeta individualmente Puntualice 10 microlitros de cultivo lavado para cada uno colar en una placa de agar TY simple.

Estos puntos son puntos de control. A continuación, agregue 40 microlitros de cada cepa, excluyendo la e coli DH five alpha que contiene Pjc dos en un tubo estéril y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 120 microlitros de esta mezcla en la placa de agar TY lisa. Este punto es el control negativo sin integrasa.

Por último, añadimos 40 microlitros de cada una de las cuatro cepas en un tubo estéril y localizamos 160 microlitros de esta mezcla en la misma placa de agar TDY. Este punto es el punto de acoplamiento de intercambio de casetes mediado por integrasa.

Coloque la placa en una campana de flujo laminar y deje que las manchas se sequen durante unos 20 minutos. Selle la placa e incube a 30 grados centígrados durante la noche el día después de la racha del protocolo de apareamiento. Los dos puntos de control y el punto de apareamiento IMCE en placas de agar TY suplementadas con estreptomicina y gentamicina.

La cepa aceptora S mili es portadora de una mutación que confiere un alto nivel de resistencia a la estreptomicina para el cálculo de la eficiencia de la IMCE Resus suspende aproximadamente una cuarta parte del punto de apareamiento de la IMCE en 500 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,85% y realiza diluciones en serie diez veces mayores a 10 a la séptima placa negativa Las diluciones tienden a los negativos dos a 10 a menos cinco en placas de agar TY suplementadas con estreptomicina, gentamicina, y xgl para seleccionar para inmigrantes trans. Las diluciones en placa tienden a los tres a 10 negativos a los siete negativos en las placas de agar TY, suplementadas con estreptomicina y xgl para seleccionar tanto para los inmigrantes trans como para los posibles receptores. Los receptores totales de IE incuban placas a 30 grados centígrados durante tres días.

Ver RFP trans bajo luz verde y a través de un filtro rojo calcule el porcentaje de eficiencia IMCE como UFC de inmigrantes trans en comparación con la UFC de los receptores totales, aproximadamente la mitad de los trans habrán sufrido un verdadero intercambio haciéndolos blancos e insensibles después de tres días de incubación en Ty suplementado con estreptomicina y gentamicina, no debería haber crecimiento en las siguientes cepas de control, no control de integrasa s milli latte UW 2 27 control e coli MT 616 control e coli DH cinco alfa que contienen P JH uno 10 control y e coli DH cinco alfa que contienen PJC dos control. Por el contrario, la raya IMCE del lugar de apareamiento debe tener un crecimiento confluente en la raya de la cabeza y muchas colonias en la segunda raya. Las siguientes dos imágenes muestran suspensiones resus de una dilución de 10 a negativo dos del punto de apareamiento en el agar TY estreptomicina xgl, y en el agar estreptomicina TY Gentamicina xgl en el agar estreptomicina TY Gentamicina xgl.

Las colonias azules son recombinantes individuales. Mientras que las colonias blancas son integrinas trans que han experimentado un verdadero intercambio de casetes cuando se ven bajo luz verde y a través de un filtro rojo, la tendencia a la dilución de dos negativos de la suspensión de apareamiento spot resus en el agar TY strept cin xgl carece de fluorescencia. Por el contrario, la dilución de 10 a menos dos de la suspensión de apareamiento resus en Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agar muestra dos niveles de fluorescencia.

Las colonias más brillantes corresponden a las colonias azules y tienen una mayor expresión de RFP, presumiblemente debido a la promoción de una lectura del promotor LAC en el vector. Las colonias menos brillantes corresponden a las colonias blancas, que han sido sometidas a un verdadero intercambio de casetes y contienen RFP con solo su promotor inmediato y sin lectura del promotor LAC. Estas tendencias de los inmigrantes también deben ser sensibles a las micinas.

La eficiencia de la integración trans expresada como el porcentaje de inmigrantes trans con respecto al total de receptores debe estar en el rango de 0.5%Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar la conjugación bacteriana utilizando nuestras cepas diseñadas para insertar construcciones de ADN en el cromosoma bacteriano.