Name: Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a integrar ADN en cromosomas bacterianos mediante conjugación y ΦC31 integrasa usando cepas con landing pad. Este método eficiente facilita modificaciones genéticas precisas en microbiología.

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Para Margaret Smith CM por la amabilidad de proporcionar el clon de la integrasa Apoyo financiero de: Genome Canada / Genome Prairie NSERC Discovery y subvenciones de proyectos estratégicos

1. Producción de la Cultura <ol><li> Preparar los medios líquidos estériles: TY 10 (5 g / l de triptona, 3 g / l de extracto de levadura, 0,44 g / l de cloruro de calcio dihidrato), y LB 11 (10 g / l de triptona, 5 g / l de extracto de levadura, 5 g / cloruro de sodio, pH 7). </li><li> Inocular a partir de una sola colonia: SmUW227 (S. meliloti LP-deformación: la construcción se describe en otro lugar, la cepa detalles de la construcción están disponibles bajo petición) () en 5 ml de TY medios de comunicación con 50 mg / ml de espectinomicina. Inocular las siguientes cepas en 5 ml de medio líquido LB, que complementa con el antibiótico que se administra: E. E. DH5a 12 contiene pJC2, la expresión integrasa plásmido, con 10 mg / ml de tetraciclina, E. E. MT616 13, el activista, con 10 mg / ml de cloramfenicol, y E. E. DH5a contiene pJH110, el casete de plásmido donante, con 5 ug / ml de gentamicina. </li><li> Incubar E. E. noche a la mañana a 37 y las cepas°; C con agitación constante. Incubar S. meliloti cepa a 30 ° C durante dos días con agitación. Es posible obtener una S. meliloti noche a la mañana con un inóculo grande (1:500 subcultura de una cultura saturada) la cultura. </li></ol> 2. Cultura preparación y mezcla <ol><li> Lavar 1,5 ml de cultivo de cada cepa por recoger el sedimento celular por centrifugación a 17.000 xg durante 30 segundos y resuspender en 1 ml estéril 0,85% de NaCl; repetir una vez. </li><li> Resuspender el pellet en 100 l de NaCl al 0,85% estéril. </li><li> Individualmente detectar 10 l de la cultura lavado para cada cepa en una placa de agar simple TY. Estos puntos son puntos de control. </li><li> Añadir 40 l de cada cepa de E. excluyendo el coli DH5a 12 que contiene pJC2 en un tubo estéril, mezclar, y el punto 120 l de esta mezcla sobre una placa de agar simple TY. Este punto es el control sin la integrasa negativo. </li><li> Añadir 40 l de cada cepa en un t estérilube, mezcla, y el punto 160 l de esta mezcla sobre una placa de agar simple TY. Este lugar es el lugar de apareamiento IMCE. </li><li> Permita que los puntos que se seque en una campana de flujo laminar. </li><li> Sello placas y se incuba a 30 ° C durante la noche. </li></ol> 3. Aislamiento de Trans-integrantes <ol><li> Manchas de imagen unidimensional de control y terreno IMCE sobre discos de agar TY complementadas con 200 ug / ml de estreptomicina (SmUW227 se basa en Rm1021 que lleva una mutación que confiere resistencia de alto nivel a la estreptomicina 14) y gentamicina 30 mg / ml. </li><li> Para el cálculo de la eficiencia IMCE, resuspender aproximadamente ¼ de la mancha de apareamiento IMCE en 500 l estéril al 0,85% de NaCl. Hacer 10 veces diluciones seriadas de 10 -7. Diluciones de placa 10 -2 a través de 10 -5 en placas de agar TY complementadas con 200 ug / ml de estreptomicina y 30 ug / ml de gentamicina, para seleccionar para trans-integrantes. Diluciones Plate 10 -3 through 10 -7 en placas de agar TY complementadas con 200 ug / ml de estreptomicina, para seleccionar para ambos trans integrantes y receptores potenciales, es decir, los receptores totales. </li><li> Para el aislamiento de markerless trans integrantes resuspender aproximadamente un cuarto del punto de acoplamiento IMCE en 500 l de estéril al 0,85% de NaCl. Hacer 10 veces diluciones seriadas hasta 10 -6. Placas 10 -4 a 10 -6 sobre cuatro placas de agar TY complementadas con 200 ug / ml de estreptomicina y 200 ug / ml de X-gluc diluciones. </li><li> Incubar las placas a 30 ° C durante 3 días. </li><li> Ver RFP trans-integrantes bajo la luz verde (525 nm) ya través de un filtro rojo (&gt; 610 nm) 15. </li><li> Calcular la eficiencia IMCE por ciento de UFC de trans-integrantes en comparación con el UFC de los beneficiarios totales. Aproximadamente la mitad de trans-integrantes se han sometido a cambio de cassette de verdad haciéndolos blanco y espectinomicina sensible. </li><li> Para encontrar los markerless trans integrantes (waquí el vector de donantes no contiene Gm r como en pJH110) la pantalla para una colonia de color blanco (un prolongado período de incubación, 1-2 días adicionales a temperatura ambiente, mejorará la diferenciación de las colonias a través de X-gluc, esto es necesario en S. meliloti SmUW227), confirman la sensibilidad de la colonia espectinomicina por el análisis en una placa de agar TY sin antibióticos y una placa de agar TY que contenía 100 mg / ml de espectinomicina. </li></ol> 4. Los resultados representativos Después de tres días de incubación en TY complementadas con estreptomicina y gentamicina las rayas de control no debe tener ningún crecimiento. La raya IMCE debe tener crecimiento confluente en la raya de cabeza y muchas colonias en la franja segundo, como se ve en la Figura 2. La eficiencia de trans-integración, expresada como el porcentaje de trans-integrantes a los destinatarios totales, debe estar en el intervalo de 0,5%. Aproximadamente la mitad de trans-integrantes será espectinomicina sensible y blancomostrando que han sido objeto de cambio de cassette de verdad. Trans-integrantes que contienen el cassette probador rfp donante de pJH110 debe mostrar fluorescencia de RFP discernible cuando se observa bajo la luz verde (525 nm) ya través de un filtro rojo (&gt; 610 nm) 15. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="Figura 1"/> . Figura 1 ilustración mezcla de conjugación: Ayudado por la expresión de los genes de transferencia de pRK600, todos los plásmidos se transfieren al azar de célula a célula. Esta transferencia de los resultados en la creación de trans-integrantes de la mezcla, a través de adquisición del sistema LP-deformación de los dos plásmidos necesarios para IMCE, la integrasa (int) pJC2 plásmido auxiliar y el pJH110 plásmido donante. El cassette de los donantes del plásmido donante no replicante (pJH110) se intercambia a través de la actividad de la integrasa ΦC31 con los marcadores de la LP-cassette en el cromosoma, lo que resulta en la pérdida de la LP-marcadores (Sp.r y uidA) y el mantenimiento de la casete de donante (RFP y r gm) en la resultante trans-integrante. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A: B placa apareamiento lugar en una placa no selectivo TY mostrando mezclas secas de células en la superficie de agar. Manchas de apareamiento en bandas sobre estreptomicina-gentamicina-X-gluc placa, desde la parte superior izquierda hacia la derecha sin control de la integrasa, IMCE en S. meliloti, E. coli DH5a que contiene el control pJC2, E. E. DH5a contiene pJH110 de control, E. E. MT616 de control, y S. . meliloti UW227 de control C: 10 -2 dilución de la resuspensión de apareamiento puesto en TY estreptomicina-X-gluc agar D:. 10 -2 dilución de la resuspensión de apareamiento puesto en TY estreptomicina-gentamicina-X-gluc agar (colonias azules son recombinantes individuales, colonias de color blanco han sido objeto de cierto. de cambio de cassette) E: 10 -2 dilución de la resuspensión de apareamiento puesto en TY estreptomicina-X-gluc agar que muestra la falta de fluorescencia F:. 10 -2 dilución de la resuspensión de apareamiento puesto en TY estreptomicina-gentamicina-X-gluc agar que muestra a dos niveles de la fluorescencia (más brillantes corresponden a las colonias de colonias de color azul y tienen una mayor expresión de rfp presumiblemente debido a la promotora de lectura-aunque a partir de la secuencia del vector, donde las colonias de haber sufrido cierto-cassette de cambio contienen RFP con sólo su promotor inmediato sin leer a través del promotor lac en el vector, que está ausente.).

<ol><li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+two+genomes+in+one+cell%3A+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La técnica IMCE permite la integración eficiente de un cassette de ADN única attB flanqueado en el LP-locus de una cepa previamente diseñado. Una vez que la construcción deseada se clona en lugar de RFP para crear el casete donante, la técnica no requiere la purificación posterior del ADN y la transformación, lo que es muy robusto. Es crítico que los controles apropiados de crecimiento se incluyen, para estar seguro de la resistencia a los antibióticos se debe a la creación de trans-integrantes y no a ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Estreptomicina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> La espectinomicina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> La tetraciclina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> Agar bacteriológico de grado </td><td&gt; Bioshop Canada Inc. </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> Triptona </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> Extracto de levadura </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-gluc </td><td> Gold Biotechnology Inc. </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli cepa MT616 </td><td> Disponible bajo pedido </td><td></td><td> También se usa fuera de nuestro laboratorio </td></tr><tr><td> E. coli cepa pJC2 </td><td> En la casa, disponible bajo pedido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> E. coli cepa pJH110 </td><td> En la casa, a disposición por request </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 cepa </td><td> En la casa, disponible bajo pedido </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sitio específico de ingeniería cromosoma bacteriano: Φc31 integrasa mediada cassette exchange (imce)

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

El cromosoma bacteriano se puede utilizar para mantener establemente ADN extraño en el intervalo de mega-base 1. La integración en el cromosoma elude cuestiones tales como la replicación del plásmido, la estabilidad del plásmido, la incompatibilidad del plásmido, y la varianza plásmido número de copias. Este método usa la integrasa sitio-específico del fago Streptomyces (Φ) C31 2,3. La integrasa ΦC31 cataliza la recombinación directa entre dos sitios de ADN específicas: attB y attP (34 y 39 pb, respectivamente) 4. Esta recombinación es estable y no se volverá 5. Una &quot;pista de aterrizaje&quot; (LP) consiste en la secuencia de un gen de resistencia a la espectinomicina, aadA (SPR), y E. de la coli ß-glucuronidasa gen (uidA) flanqueado por sitios attP se ha integrado en los cromosomas de Sinorhizobium meliloti, anthropi Ochrobactrum y Agrobacterium tumefaciens en una región intergénica, el ampC locus, y el locus tetA, respectivamente. S. meliloti se utiliza en este protocolo. Vectores que contienen sitios donantes movilizable attB flanquean una embutidora rojo proteína fluorescente (RFP) de genes y un gen de resistencia a antibióticos se han construido. En este ejemplo la gentamicina pJH110 plásmido resistente se utiliza. El gen rfp 6 puede ser reemplazado con un constructo deseado utilizando Sph I y Pst I. Alternativamente una construcción sintética flanqueado por sitios attB puede ser sub-clonado en un vector movilizable como pK19mob 7. La expresión del gen de la integrasa ΦC31 (clonado a partir de pHS62 8) es impulsado por el promotor lac, en una amplia gama de huéspedes movilizable plásmido pRK7813 9. Un protocolo de apareamiento tetraparental se utiliza para transferir el cassette en la cepa donante LP reemplazando así los marcadores en la secuencia de LP con el cassette de donantes. Estas células son trans-integrantes. Trans-integrantes se forman con una eficiencia típica de 0,5%. Trans-integrantes se encuentran típicamente en los primeros 500-1,000 colonias seleccionadas por la sensibilidad a antibióticos o cribado azul-blanco, utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucurónico (X-gluc). Este protocolo contiene los procedimientos de apareamiento y la selección para la creación y aislando trans integrantes.

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

El cromosoma bacteriano puede utilizarse para mantener de forma estable ADN foráneo en el rango de los megabases1. La integración en el cromosoma evita problemas tales como...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en integrar un constructo de ADN deseado en el cromosoma bacteriano en un locus predeterminado. Esto se logra mediante un protocolo de apareamiento que involucra cuatro cepas bacterianas modificadas. La cepa receptora posee una secuencia de aterrizaje compuesta por un gen de resistencia a la espectinomicina y el gen de la beta-glucuronidasa de E. coli, flanqueados por sitios ATP, integrados en su cromosoma.La cepa donadora PJH uno 10 porta un plásmido que contiene sitios B que flanquean un gen de relleno que codifica una proteína fluorescente roja, y un gen de resistencia a antibióticos. La cepa donadora PJC dos porta un plásmido que contiene la integrasa específica de sitio del fago Streptomyces C31 bajo el control del promotor LAC. La cuarta cepa MT616 proporciona los genes de transferencia necesarios para la conjugación, la transferencia de plásmidos de célula a célula, lo que resulta en la creación de trans a través de las cepas receptoras.Adquisición de los dos plásmidos necesarios para el intercambio de cassettes mediado por integrasa. El intercambio del cassette donador del plásmido PJ H one 10 con los marcadores del cassette de aterrizaje en el cromosoma da como resultado la pérdida de los marcadores del cassette de aterrizaje, SPR y UIDA, y el mantenimiento de los marcadores del cassette donador, RFP y GMR, en el transinmigrante resultante. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la recombinación homóloga es la facilidad y eficiencia del protocolo.También es transferible a una amplia variedad de bacterias. La cepa receptora utilizada en este video es una cepa de S milli latte, dos días antes del procedimiento de apareamiento, para crear transintegrinas, inóculense a partir de una colonia individual en cinco mililitros de medio TY con espectinomicina. Incubar la cepa de S milli a 30 grados Celsius durante dos días con agitación, el día anterior al procedimiento de apareamiento, inóculense cada una de las siguientes cepas de E. coli en cinco mililitros de medio líquido LB suplementado con el antibiótico apropiado: DH5α que contiene el plásmido de expresión de integrasa en medio con tetraciclina, MT616, el movilizador intermedio con cloranfenicol, y DH5α que contiene el plásmido del casete donador en medio con gentamicina. Incubar las tres cepas de E. coli durante la noche a 37 grados Celsius con agitación constante para preparar las células para el procedimiento de apareamiento. Transferir 1,5 mililitros de cada uno de los cuatro cultivos a un tubo y centrifugar a 17.000 × g durante 30 segundos para recoger el botón celular, desechar el medio y resuspender cada botón celular en un mililitro de cloruro de sodio estéril al 0,85 %. Centrifugar nuevamente los tubos tras desechar el sobrenadante y resuspender cada botón en 100 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,85 % utilizando una pipeta. Aplicar individualmente 10 microlitros de cultivo lavado de cada cepa sobre una placa de agar TY sin suplementos.Estos puntos son puntos de control. A continuación, agregue 40 microlitros de cada cepa, excluyendo la E. coli DH cinco alfa que contiene Pjc dos, en un tubo estéril y mezcle pipeteando arriba y abajo. Coloque 120 microlitros de esta mezcla sobre la placa de agar TY simple. Este punto es el control negativo sin integrasa.Finalmente, agregue 40 microlitros de cada una de las cuatro cepas en un tubo estéril, mezcle y coloque 160 microlitros de esta mezcla en la misma placa de agar TDY. Este punto es el punto de apareamiento para el intercambio de cassetes mediado por integrasa.Coloque la placa en una cabina de flujo laminar y deje secar las colonias durante aproximadamente 20 minutos después de eso. Selle la placa e incúbela a 30 grados Celsius durante la noche, al día siguiente de la siembra según el protocolo de apareamiento. Los dos puntos de control y el punto de apareamiento IMCE en placas de agar TY suplementadas con estreptomicina y gentamicina.La cepa receptora S milli porta una mutación que confiere resistencia de alto nivel a la estreptomicina para el cálculo de la eficiencia de IMCE. Resuspender aproximadamente una cuarta parte del punto de apareamiento de IMCE en 500 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,85 %. Realizar diluciones seriadas diez veces hasta 10 a la menos siete. Sembrar las diluciones desde 10 a la menos dos hasta 10 a la menos cinco en placas de agar TY suplementadas con estreptomicina, gentamicina y xgl para seleccionar los transinmigrantes. Sembrar las diluciones desde 10 a la menos tres hasta 10 a la menos siete en placas de agar TY suplementadas con estreptomicina y xgl para seleccionar tanto los transinmigrantes como los posibles receptores. Incubar las placas a 30 grados Celsius durante tres días para obtener el número total de receptores.Observe la transmisión de RFP bajo luz verde y a través de un filtro rojo; calcule el porcentaje de eficiencia IMCE como el número de UFC de los transconjugantes en comparación con el número de UFC de los receptores totales. Aproximadamente la mitad de los transconjugantes habrán experimentado un intercambio verdadero, volviéndose blancos e insensibles tras tres días de incubación en Ty suplementado con estreptomicina y gentamicina. No debe haber crecimiento en las siguientes cepas de control: control sin integrasa, s. millilata UW 2 27, control E. coli MT 616, control E. coli DH5α conteniendo pJH110, y control E. coli DH5α conteniendo pJC2. En contraste, el aislamiento IMCE procedente del punto de conjugación debe presentar crecimiento confluyente en la primera estría y muchas colonias en la segunda estría. Estas dos imágenes siguientes muestran suspensiones resuspendidas de una dilución 10 a la menos dos del punto de conjugación en agar TY-estreptomicina-xgl, y en agar TY-estreptomicina-gentamicina-xgl, respectivamente, en agar TY-estreptomicina-gentamicina-xgl.Las colonias azules son recombinantes simples. Mientras que las colonias blancas son transintegrinas que han experimentado un intercambio real de casete cuando se observan bajo luz verde y a través de un filtro rojo, tienden a no presentar fluorescencia en la dilución 10⁻² de la suspensión de resuspensión del punto de apareamiento en agar TY strept cin xgl. En contraste, la dilución 10⁻² de la suspensión de resuspensión del punto de apareamiento en agar Ty estreptomicina gentamicina Xgl muestra dos niveles de fluorescencia.Las colonias más brillantes corresponden a colonias azules y presentan una mayor expresión de RFP, posiblemente debido a una lectura continua desde el promotor LAC en el vector. Las colonias menos brillantes corresponden a colonias blancas, que han experimentado un intercambio verdadero del casete y contienen RFP con solo su promotor inmediato y sin lectura continua desde el promotor LAC. Se espera que estas tendencias también sean sensibles a la espectinomicina.La eficiencia de la integración en trans, expresada como el porcentaje de inmigrantes en trans respecto al número total de receptores, debe estar en el rango de 0,5 %. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la conjugación bacteriana mediante nuestras cepas modificadas para insertar construcciones de ADN en el cromosoma bacteriano.

site-specific-bacterial-chromosome-engineering-c31-integrase-mediated

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Investigación

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Bioingeniería

En este vídeo, demostramos la integración de transgenes específicos del sitio mediada por phiC31 en el embrión de Anopheles mediante microinyección. Este método ayuda a introducir los genes deseados en un sistema huésped para aplicaciones industriales y de investigación.

phiC31-Integración de transgenes dirigidos en el sitio mediada por integrasa: una técnica de microinyección para la integración de transgenes específicos del sitio en un vector Anopheles

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Screening productos alimenticios para la Clase 1 integrones y Gene Cassettes

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Presentado aquí es un método simple para crear una biblioteca de inserción del transposón alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri mediante Conjugación bacteriana. Este protocolo permite la creación de una colección de cientos de miles de mutantes únicos en bacterias por la inserción genómica al azar de un transposón.

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

Aquí presentamos un protocolo para el uso de preexistentes antibiótico resistencia-cassette borrado construcciones como base para la fabricación de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . Tales mutaciones de la canceladura pueden ser movilizados e inserta en el correspondiente locus de una cepa receptora mediante transducción de bacteriófago P1.

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Aquí se describe un método para la eliminación de genes dirigida y sin marcadores en Chlamydia trachomatis mediante mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed, FLAEM.

Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en Chlamydia trachomatis

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Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

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Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

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Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

Hemos desarrollado una matriz extracelular y de pulmón descelularizada biorreactor novela biomiméticos que se puede utilizar para generar tejido pulmonar funcional. Por la siembra de las células en la matriz y el cultivo en el biorreactor, que generan tejido que demuestra el intercambio de gases eficaz cuando se trasplantan en vivo por periodos cortos de tiempo.

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Aprende a integrar ADN en cromosomas bacterianos mediante conjugación y ΦC31 integrasa usando cepas con landing pad. Este método eficiente facilita modificaciones genéticas precisas en microbiología.

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