Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

El objetivo general del siguiente experimento consiste en integrar un constructo de ADN deseado en el cromosoma bacteriano en un locus predeterminado. Esto se logra mediante un protocolo de conjugación que involucra cuatro cepas bacterianas modificadas. La cepa receptora posee una secuencia de aterrizaje compuesta por un gen de resistencia a la espectinomicina y el gen de la beta-glucuronidasa de e. coli, flanqueados por sitios ATP, integrados en su cromosoma.

La cepa donadora P JH uno 10 lleva un plásmido que contiene sitios B que flanquean un gen de relleno de proteína fluorescente roja y un gen de resistencia a antibióticos. La cepa donadora PJC dos lleva un plásmido que contiene la integrasa específica de sitio del fago streptomyces C 31 bajo el control del promotor LAC. La cuarta cepa MT 616 proporciona los genes de transferencia necesarios para la conjugación, la transferencia de plásmidos de célula a célula, lo que resulta en la creación de trans a través de las cepas receptoras.

Adquisición de los dos plásmidos necesarios para el intercambio de casetes mediado por integrasa. El intercambio del casete donador del plásmido PJ H one 10 con los marcadores del casete de la plataforma integradora en el cromosoma da como resultado la pérdida de los marcadores de la plataforma integradora, SPR y UIDA, y la conservación de los marcadores del casete donador, RFP y GMR, en el transinmigrante resultante. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la recombinación homóloga es la facilidad y eficiencia del protocolo.

También es transferible a una amplia variedad de bacterias. La cepa receptora utilizada en este video es una cepa de S milli latte dos días antes del procedimiento de apareamiento; para crear transintegrinas, inocular a partir de una colonia individual en cinco mililitros de medio TY con espectinomicina. Incubar la cepa de S milli a 30 grados Celsius durante dos días con agitación, el día anterior al procedimiento de apareamiento. Inocular cada una de las siguientes cepas de E. coli en cinco mililitros de medio líquido LB suplementado con el antibiótico apropiado: DH5α que contiene el plásmido de expresión de integrasa en medio con tetraciclina, MT616, el movilizador intermedio con cloranfenicol, y DH5α que contiene el plásmido del casete donador en medio con gentamicina. Incubar las tres cepas de E. coli durante la noche a 37 grados Celsius con agitación constante para preparar las células para el procedimiento de apareamiento. Transferir 1,5 mililitros de cada una de las cuatro culturas a un tubo y centrifugar a 17.000 × g durante 30 segundos para recoger el botón celular, desechar el medio y resuspender cada botón celular en un mililitro de cloruro de sodio estéril al 0,85 %. Centrifugar nuevamente los tubos tras desechar el sobrenadante. Resuspender cada botón en 100 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,85 % utilizando una pipeta. Aplicar individualmente 10 microlitros de la cultura lavada de cada cepa sobre una placa de agar TY sin suplementos.

Estos puntos son puntos de control. A continuación, agregue 40 microlitros de cada cepa, excluyendo la E. coli DH5α que contiene el Pjc2, en un tubo estéril y mezcle pipeteando arriba y abajo. Coloque 120 microlitros de esta mezcla sobre la placa de agar TY simple. Este punto es el control negativo sin integrasa.

Finalmente, agregue 40 microlitros de cada una de las cuatro cepas en un tubo estéril, mezcle y coloque 160 microlitros de esta mezcla en la misma placa de agar TDY. Este punto es el punto de apareamiento para el intercambio de casetes mediado por integrasa.

Coloque la placa en una cabina de flujo laminar y deje secar las colonias durante aproximadamente 20 minutos después de eso. Selle la placa e incúbela a 30 grados Celsius durante la noche, al día siguiente de la siembra según el protocolo de apareamiento. Los dos puntos de control y el punto de apareamiento IMCE en placas de agar TY suplementadas con estreptomicina y gentamicina.

La cepa receptora S milli porta una mutación que confiere resistencia de alto nivel a la estreptomicina para el cálculo de la eficiencia de IMCE. Re-suspender aproximadamente una cuarta parte del punto de apareamiento de IMCE en 500 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,85 %. Realizar diluciones seriadas diez veces hasta 10 a la menos siete. Sembrar las diluciones desde 10 a la menos dos hasta 10 a la menos cinco en placas de agar TY suplementadas con estreptomicina, gentamicina y xgl para seleccionar los transinmigrantes. Sembrar las diluciones desde 10 a la menos tres hasta 10 a la menos siete en placas de agar TY suplementadas con estreptomicina y xgl para seleccionar tanto los transinmigrantes como los posibles receptores. Incubar las placas con los receptores totales a 30 grados Celsius durante tres días.

Observe la transmisión de RFP bajo luz verde y a través de un filtro rojo; calcule el porcentaje de eficiencia IMCE como el número de UFC de los transconjugantes en comparación con el número de UFC de los receptores totales. Aproximadamente la mitad de los transconjugantes habrán experimentado un intercambio verdadero, convirtiéndolos en colonias blancas e insensibles tras tres días de incubación en medio Ty suplementado con estreptomicina y gentamicina. No debe haber crecimiento en las siguientes cepas de control: control sin integrasa, s. millilata UW227, control E. coli MT616, control E. coli DH5α que contiene pJH110, y control E. coli DH5α que contiene pJC2. En contraste, el aislamiento IMCE procedente del punto de conjugación debe presentar un crecimiento confluyente en la primera estría y muchas colonias en la segunda estría. Estas dos imágenes siguientes muestran suspensiones resuspendidas de una dilución 10⁻² del punto de conjugación en agar TY con estreptomicina y X-Gluc, y en agar TY con estreptomicina, gentamicina y X-Gluc.

Las colonias azules son recombinantes simples. Mientras que las colonias blancas son transintegrinas que han experimentado un intercambio verdadero de casete cuando se observan bajo luz verde y a través de un filtro rojo, tienden a no presentar fluorescencia en la dilución 10⁻² de la suspensión de resuspensión del punto de apareamiento en agar TY strept cin xgl. En contraste, la dilución 10⁻² de la suspensión de resuspensión del punto de apareamiento en agar Ty estreptomicina gentamicina Xgl muestra dos niveles de fluorescencia.

Las colonias más brillantes corresponden a colonias azules y presentan una mayor expresión de RFP, presumiblemente debido a una lectura continua desde el promotor LAC en el vector. Las colonias menos brillantes corresponden a colonias blancas, que han experimentado un intercambio verdadero del casete y contienen RFP con solo su promotor inmediato y sin lectura continua desde el promotor LAC. Se espera que estas tendencias también sean sensibles a la espectinomicina.

La eficiencia de la integración en trans, expresada como el porcentaje de inmigrantes en trans respecto al número total de receptores, debe estar en el rango de 0,5 %. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la conjugación bacteriana mediante nuestras cepas modificadas para insertar construcciones de ADN en el cromosoma bacteriano.