Transformación de genes basada en vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios en plantas de Arabidopsis: una técnica para generar plantas transgénicas con inserción de una sola copia

Comience con plantas de Arabidopsis con cabezas de flores inmaduras. Sumerja las cabezas de las flores en la suspensión celular de Agrobacterium que lleva ADN-T clonado con cromosoma artificial bacteriano binario o BIBAC, un vector que se replica en los sistemas E. coli y Agrobacterium. Este vector binario de ADN-T puede administrar transgenes grandes, como genes de resistencia a herbicidas y marcadores seleccionables fluorescentes a lo largo de un promotor específico de semillas.

Mientras las cabezas de las flores aún están sumergidas, agite suavemente las plantas para mejorar su contacto con Agrobacterium. Con su capacidad inherente para infectar plantas, Agrobacterium transfiere el transgén a la célula floral. A medida que el transgén ingresa a la célula, se mueve hacia el núcleo y se fusiona con el genoma de la planta.

Ahora, envuelva la planta en film transparente e incube en la oscuridad para retener la humedad y mejorar la transformación. Retire la película y cultive las plantas en condiciones fisiológicas hasta que produzcan semillas.

A continuación, coseche las semillas y observe bajo un microscopio de fluorescencia para seleccionar los transformadores. Ahora, cultive las semillas transformadas en condiciones adecuadas hasta la germinación. Rocíe las plantas con herbicida e incube.

Las plantas con inserción de múltiples transgenes experimentan silenciamiento génico y se marchitan, mientras que las plantas con inserción de una sola copia expresan una enzima metabolizadora de herbicidas activa y sobreviven al tratamiento. Extraiga ADN genómico de los transformadores supervivientes y realice PCR para calcular la eficiencia de la inserción de una sola copia.

Para preparar las plantas de Arabidopsis para la transformación, cultive las plantas de Arabidopsis en un invernadero o cámara de crecimiento con clima controlado, hasta que estén floreciendo. Sujete los primeros pernos para permitir que emerjan más pernos secundarios. Las plantas están listas para sumergirse de cuatro a seis días después del recorte, cuando las plantas tienen muchas cabezas de flores inmaduras y no muchas silicuas fertilizadas.

Para realizar la inmersión floral, sumerja las inflorescencias durante 5 a 10 segundos en suspensión de Agrobacterium. Use una agitación suave. Envuelva las partes aéreas de las plantas en una película adhesiva para mantener la humedad alta y cubra las macetas con una caja para mantener las plantas en la oscuridad.

Incube las plantas durante dos días en un invernadero o cámara de crecimiento. Después de dos días, retire la caja y la película adhesiva y cultive las plantas hasta la madurez en un invernadero o cámara de crecimiento. Para aumentar la eficiencia de la transformación, las mismas plantas se pueden volver a sumergir siete días después de la primera inmersión.

Luego, cuando las plantas transformadas estén maduras y secas, coseche las semillas. Reúne y analiza las semillas de plantas transformadas con la misma construcción como un solo conjunto. En caso de que las plantas se transformen con un derivado plásmido BIBAC-RFP-Gateway, identifique las plantas transgénicas analizando las semillas mediante microscopía de fluorescencia.

Para detectar la expresión de DsRed en las cubiertas de las semillas, obtenga imágenes de las semillas con una excitación de 560 nanómetros y una emisión de 600 a 650 nanómetros. Separe las semillas fluorescentes de las contrapartes no fluorescentes con fórceps.

Para detectar plantas transgénicas transformadas con un derivado plásmido BIBAC-BAR-Gateway, siembre las semillas en bandejas llenas de tierra. Asegure una distribución uniforme de las semillas en las bandejas, suspendiendo las semillas en agar al 0,1% en medio MS 0,5X, y extienda las semillas con una pipeta de 1 mililitro.

Estimule las semillas para que germinen de manera sincrónica incubando las semillas durante al menos dos días a 4 grados centígrados. Esto se puede hacer antes o después de sembrar las semillas. Dos y tres semanas después de sembrar las semillas, rocíe las plántulas con una solución de glufosinato de amonio al 0,5%. Use 500 mililitros de solución de glufosinato de amonio por 1 metro cuadrado. Transfiera las plántulas sobrevivientes a macetas. Analizar las plantas resistentes al glufosinato de amonio, por PCR para detectar la presencia del constructo de interés.