Administración de genes lentivirales asistida por láser: una técnica para permeabilizar óvulos fertilizados de ratón para facilitar la entrega de genes lentivirales

La administración de genes lentivirales asistida por láser es una técnica para transferir un transgén a un sistema huésped.

Para producir ratones transgénicos, comience con huevos fertilizados de ratón aislados en un medio de cultivo adecuado. Coloque la placa de cultivo que contiene huevos fertilizados en una platina de microscopio preinstalada con un aparato láser y conectada a un software de control. Observe con un aumento adecuado.

Los huevos fertilizados están rodeados por zona pelúcida, una capa protectora de glicoproteína que protege las partículas lentivirales. Para penetrar esta barrera, encienda el aparato láser y asegúrese de que el LED láser sea visible sobre la zona pelúcida. Usando el software de control, dispara el láser. Ajuste la duración de la cocción de acuerdo con el diámetro de perforación deseado.

Coloque los huevos en una incubadora para su recuperación. Después de una breve incubación, retire los huevos y agregue partículas de lentivirus que lleven el gen de interés y un marcador seleccionable fluorescente.

Con la zona pelúcida perforada, el lentivirus se difunde fácilmente hacia la membrana del óvulo y entra a través de la endocitosis. El lentivirus se desensambla, liberando su ARN, que, cuando se procesa secuencialmente en un ADN bicatenario, ingresa al núcleo del huésped, integrando los genes extraños en el genoma del huésped.

Incube los huevos y permita que se conviertan en blastocistos. Implante los blastocistos en ratones hembra apareados. Una vez que se complete la gestación, recupere a las crías y analícelas para detectar la presencia de transgenes.

Mientras los huevos están en la incubadora, configure y calibre el láser XYClone de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Cuando los huevos estén listos, coloque la primera placa de caída en la platina del microscopio láser y enfoque manualmente la zona pelúcida. Después de confirmar que la luz LED láser es visible a través del objetivo, mueva la platina del microscopio para apuntar a la zona con el láser LED y use el software de computadora para configurar el láser XYClone a 250 microsegundos.

Ajuste el tamaño de la luz LED a las dimensiones apropiadas y perfore la zona pelúcida de cada huevo tres veces con el láser para producir tres orificios de 10 micrómetros.

Es fundamental realizar la perforación de forma rápida pero cuidadosa, ya que los óvulos fertilizados no pueden permanecer fuera de la incubadora por más de 15 minutos.

Luego, regrese los huevos perforados a la incubadora durante otras dos horas. Al final de la segunda incubación, trate la gota de KSOM de 50 microlitros con 2 microlitros de lentivirus concentrado sin mezclar y devuelva los huevos a la incubadora durante cuatro días. Cuando los óvulos se hayan convertido en blastocistos, use un dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico para depositar aproximadamente de 10 a 15 embriones en aproximadamente 2 microlitros de KSOM.

17 días después de la transferencia embrionaria, permita que la rata preñada dé a luz de forma natural o recoja a los recién nacidos por cesárea según sea necesario.