Ensayo colorimétrico para la cuantificación de hidratos de carbono no estructurales en tejidos vegetales

Los carbohidratos digeribles son los componentes no estructurales del tejido vegetal y funcionan como una fuente de energía de reserva para el crecimiento y el metabolismo de las plantas.

Para cuantificar los carbohidratos no estructurales, tome una cantidad medida de tejido vegetal en un tubo. Agregue ácido sulfúrico diluido al tubo y caliente la muestra. Al calentarse, el ácido sulfúrico hidroliza los polisacáridos de los carbohidratos digeribles en sus respectivas subunidades de monosacáridos.

Enfríe la muestra. Centrifugar el tubo para granular el material vegetal no digerido y obtener un sobrenadante que contenga los monosacáridos.

Aspire el sobrenadante en un tubo nuevo y trate los monosacáridos con una solución de fenol, seguido de la adición de ácido sulfúrico. Agite el tubo para mezclar el contenido e incubar.

Durante la incubación, el ácido sulfúrico deshidrata los monosacáridos para producir derivados furfurales. Estos derivados furfurales reaccionan con el fenol para producir una solución de oro amarillo.

Determine espectroscópicamente la absorbancia de la solución de oro amarillo a 490 nanómetros, que corresponde al contenido de carbohidratos en la muestra de la planta.

A continuación, tome varias concentraciones de soluciones de glucosa y repita el tratamiento con ácido sulfúrico de fenol para obtener diferentes intensidades de color y trace una curva estándar. Compare el valor de absorbancia de la muestra de carbohidratos desconocidos con el estándar de glucosa para obtener el contenido de carbohidratos digeribles en el tejido vegetal.

Primero, pese las réplicas de cada muestra de tejido en tubos de vidrio de 15 mililitros. Etiquete los tubos y registre la masa exacta de cada muestra.

Luego, agregue 1 mililitro de ácido sulfúrico molar 0.1 molar a cada tubo y cierre bien las tapas. Luego, coloque los tubos en un baño de agua hirviendo durante 1 hora.

Transfiera los tubos a un baño de agua tibia para que se enfríen. Luego, vierta el contenido de los tubos en tubos de microcentrífuga etiquetados de 1.5 mililitros. Después de esto, centrifuga los tubos a 15.000 g durante 10 minutos. Use una micropipeta para transferir el sobrenadante a tubos nuevos etiquetados de 1,5 mililitros.

Con una pipeta, transfiera 15 microlitros de cada muestra desconocida a su propio tubo de ensayo. Luego, agregue 385 microlitros de agua destilada a cada tubo.

En una campana extractora, agregue 400 microlitros de fenol al 5% a cada tubo de ensayo de muestra estándar y desconocido. Inmediatamente después, agregue 2 mililitros de ácido sulfúrico a cada tubo.

Asegúrese de agregar el ácido sulfúrico a la superficie de la solución.

Después de incubar los tubos durante 10 minutos, agite los tubos. Luego, incube el tubo durante 30 minutos más.

Transfiera 800 microlitros de cada tubo de muestra a tres semimicro cubetas de poliestireno de 1,5 mililitros. Luego, configure el espectrofotómetro para que lea a 490 nanómetros y calibrítelo con una cubeta en blanco.

Finalmente, pase cada cubeta a través del espectrofotómetro y registre la absorbancia.