Name: Un método de preparación de muestra eficiente para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a preparar muestras de carbohidratos para espectrometría de masas MALDI mediante recristalización con metanol. Este método optimizado mejora la intensidad de señal ionica y la calidad de datos analíticos.

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Los autores no tienen ninguna agradecimientos.

1. preacondicionamiento de la placa de la muestra
<ol><li>
Limpieza de la placa de la muestra
	<ol>
<li>Guantes de nitrilo para evitar la contaminación de la placa de la muestra durante la limpieza.</li>
		<li>Lave la placa de la muestra con 100,0 mL de una solución de detergente (1.0 mg/mL).</li>
		<li>Lave la placa de la muestra con agua destilada-desionizada (DDW).</li>
		<li>Enjuague la superficie de la placa de muestra con 30,0 mL de MeOH.</li>
		<li>Poner la placa de la muestra en un vaso de precipitados de 600 mL y llenar con DDW hasta la placa de la muestra se sumerge totalmente en agua.</li>
		<li>Poner el vaso en un ultrasonido baño (véase tabla de materiales) y someter a ultrasonidos la placa de la muestra durante 15 minutos (200 W, 40 kHz).</li>
		<li>Saque la placa de la muestra y descargue gotas de agua con nitrógeno a presión.</li>
		<li>Depósito de 0.2 μl de MeOH en el plato de muestra para comprobar si MeOH se disemina a otros lugares. Nota: Si MeOH se combina con otros puntos, repita los pasos 1.1.3-1.1.5; Si no es así, proceder al siguiente paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Regulación de la temperatura de la cámara de secado
	<ol>
<li>Utilice una cámara de secado bajo condiciones constantes para secar gotas, como se describió anteriormente11,12,13. En particular, utilice el procedimiento detallado que se describe en pasos 2.1-2.5 de Ou, Y. M. et al. 201612. Brevemente:<ol>
<li>Purgar la cámara de secado por temperatura de nitrógeno a un flujo constante para mantener un ambiente de baja humedad relativa.</li>
			<li>Mantener la muestra placa temperatura constante y regular - (25 ° C) o condiciones de rápido secado (50 ° C), regulada por un bloque de cobre con control de temperatura en la cámara de secado.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de soluciones de matriz y analito
	<ol>
<li>
Preparación de soluciones de matriz
		<ol>
<li>DHB se disuelven en 50% acetonitrilo (ACN): 50% DDW para preparar una solución de 0,1 M.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparación de analitos de hidratos de carbono
		<ol>
<li>Disolver SLeA en DDW para preparar una solución de M-4 10.</li>
			<li>Disolver el MH en DDW para preparar una solución de 10-4 M.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. muestra de deposición y recristalización
Nota: Aquí se describen los procedimientos optimizados para el análisis de cantidades pequeñas y regulares de las muestras. Asegúrese de que la temperatura de la placa muestra se estabiliza en la temperatura deseada antes de depositar las soluciones. Si la muestra se extiende sobre un área grande para cubrir otros puntos de la muestra durante la recristalización, preparar una nueva muestra o repita el paso 1.1.
<ol><li>
Para el análisis de una pequeña cantidad (0,1 μl) de muestra Nota: se han desarrollado los siguientes pasos para minimizar el consumo de muestra y el tiempo. Es conveniente para el análisis cuantitativo de muestras reales con una cantidad limitada o IMS rápido para análisis de cuantificación.<ol>
<li>Mezcla preparada de antemano 0.25 μl de solución DHB y 0.25 μl de SLeA o solución de MH en un tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Vórtice la solución mezclada con un mezclador de vórtice para 3 s.</li>
		<li>Desactivación de la solución mezclada en una mini centrífuga de 2 s (2000 x g).</li>
		<li>Utilice una pipeta para extraer 0.1 μl de la solución premezclada y depositarlo inmediatamente en la placa de la muestra. Nota: Al depositar una pequeña cantidad de muestra, No se debe mantener la solución premezclada en la punta de la pipeta por más de 10 s.</li>
		<li>Espere a que la muestra a secar. Tiempos de secado típico se enumeran en la tabla 1.</li>
		<li>Utilice una pipeta depositar 0.2 μl de MeOH derecha en el lugar de la muestra seca. Se obtendrá la muestra húmeda y seque inmediatamente. Nota: Asegurar que el procedimiento de deposición se acaba en 3 s para evitar pérdidas por evaporación significativa de MeOH.</li>
		<li>Examinar la muestra con un microscopio. Si las morfologías de cristal no son como se esperaba (ver figura 1 , por ejemplo de los resultados deseados), repita los pasos 2.1.1-2.1.6 para preparar una nueva muestra.</li>
		<li>Guantes de nitrilo y cuidadosamente saque la placa de la muestra de la cámara de secado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para el análisis de una cantidad regular (1 μl) de muestra Nota: Se desarrollan los siguientes pasos para maximizar la homogeneidad de las muestras de carbohidratos típicamente utilizado cantidad de muestra MALDI. El proceso es conveniente para la rutina y análisis cuantitativos. El proceso de recristalización redistribuye las muestras y matrices uniformemente a áreas más grandes.<ol>
<li>Mezcle 2,5 μl de solución DHB y 2,5 μl SLeA o solución de MH en un tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Vórtice de la solución premezclada con un mezclador de tipo vórtex durante 5 s.</li>
		<li>Desactivación de la solución mezclada en una mini centrífuga de 2 s (2000 x g).</li>
		<li>Utilice una pipeta para extraer 1,0 μL de la solución premezclada y depositarlo inmediatamente en la placa de la muestra. Nota: no uso el restante premezclado solución otra vez después de depositar las muestras.</li>
		<li>Espere a que la muestra a secar. Tiempos de secado típico se enumeran en la tabla 1.</li>
		<li>Utilice una pipeta depositar 1,5 μl de MeOH derecha en el lugar de la muestra seca. Se obtendrá la muestra húmeda y seque inmediatamente. Nota: En casos con temperatura de la placa de alto (50 ° C), el paso de recristalización debe hacerse dentro de 5 s para minimizar la evaporación de MeOH en punta de la pipeta.</li>
		<li>Examinar la muestra con un microscopio. Si las morfologías de cristal no son como se esperaba (ver figura 1 , por ejemplo de los resultados deseados), repita los pasos 2.2.1-2.2.6 para preparar una nueva muestra.</li>
		<li>Guantes de nitrilo y cuidadosamente saque la placa de la muestra de la cámara de secado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. datos de espectrometría de masas de adquisición y análisis
Nota: El análisis se realiza utilizando un espectrómetro tiempo-de-vuelo comercial de masas (Tabla de materiales) equipado con una fuente de iones MALDI. El instrumento es operado por el software de control específico (Tabla de materiales) con energía de retardo y láser de extracción previamente optimizado. Los espectros se registran de modo lineal con una gran gama de m/z = 0 – 1500. El potencial de la placa de la muestra es ±25 keV y cada espectro promedio de 10 disparos de láser. Los usuarios deben realizar optimización del instrumento y análisis de muestras usando software compatible y siga las instrucciones del fabricante del instrumento.
<ol><li>Abra el software de control del instrumento (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Inserte la placa de la muestra en el espectrómetro de masas.</li>
	<li>Seleccione el método de adquisición de datos previamente optimizado en el software.</li>
	<li>Registrar la región de toda la muestra para IMS mediante el software de la proyección de imagen (véase Tabla de materiales). Nota: Omita este paso si no haciendo IMS.</li>
	<li>Inicio de adquisición de datos en el modo por lotes del software de control.</li>
	<li>Trama las imágenes de ion usando el software de imágenes después de completar la adquisición de datos.</li>
	<li>Analizar espectros de masas utilizando el software de análisis (véase Tabla de materiales) si los datos se graban sin una imagen de ion.</li>
</ol>

<ol><li>Holme, D. J., Peck, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolme%2C+DJ+%22Analytical+Biochemistry%22">Analytical Biochemistry</a>. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).</li>
<li>Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time%2C+life+...+and+mass+spectrometry+-+New+techniques+to+address+biological+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions.</a> Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).</li>
<li>Caroff, M., Karibian, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14670707">Structure of bacterial lipopolysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).</li>
<li>Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+in+clinical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry.</a> Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10639030">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates.</a> Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).</li>
<li>Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+chromatographic%2C+electrophoretic+and+mass+spectrometric+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis.</a> Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).</li>
<li>Nishikaze, T., Amano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+thin+layer+method+for+enhanced+ion+yield+of+oligosaccharides+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).</li>
<li>Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrix+crystal+structure+on+ion+abundance+of+carbohydrates+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).</li>
<li>Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fast-evaporation+sample+preparation+method+for+improving+quantification+of+angiotensin+II+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).</li>
<li>Lai, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).</li>
<li>Ou, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Homogeneous+MALDI+Samples+for+Quantitative+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54409(2016).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+carbohydrate+ion+yield+by+controlling+crystalline+structures+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).</li>
<li>Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0169433296005302">Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes.</a> Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).</li>
<li>Sadeghi, M., Vertes, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169433297006363">Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization.</a> Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Heterogeneidad de la muestra es que un problema crucial en MALDI-Sra. DD es el más comúnmente utilizado método de preparación de la muestra, pero los cristales resultantes son altamente heterogéneos. Dichas muestras demostración reproductibilidad pobre señal de tiro a tiro y muestra a muestra. Por lo tanto, buscar "puntos" en áreas de la muestra durante la adquisición de datos es un procedimiento común en los experimentos MALDI. Dichas muestras heterogéneas no son adecuadas para la cuantificación en análisis de rutina.</...

Análisis de hidratos de carbono es un tema importante y desafiante. Hidratos de carbono y sus derivados desempeñan papeles importantes en vivir organismos1,2,3. Estas moléculas han complicado las estructuras y son propensas a descomponerse. Muchos de ellos no pueden ser claramente caracterizados debido a las dificultades en la separación y detección. Aunque láser asistida por matriz (MALDI) de desorción/ionización espectrometría de masas (MS) se ha aplicado al análisis de una amplia variedad de biomoléculas, debido a su sensibilidad y resultados comprensibles4, análisis de carbohidratos mediante MALDI-MS continúa para ser un gran desafío debido a la eficiencia de baja ionización de tales moléculas5. Derivatización química es una forma común para mejorar la eficiencia de la ionización de hidratos de carbono6,7, pero estos procedimientos son tiempo y consumo de la muestra. Además, la eficacia de la ionización de carbohidratos derivatizados es todavía más baja que la de las proteínas. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de métodos para mejorar la señal de hidratos de carbono en MALDI-MS sin procedimientos complicados.
La aplicación del MALDI-MS para análisis cuantitativo es otro tema difícil. Un problema importante de MALDI-MS es que su sensibilidad y datos de reproducibilidad depende críticamente protocolos de preparación de muestra y parámetros experimentales. En muchos casos, análisis cuantitativo por MALDI-MS no es confiable debido a la morfología heterogénea muestra y distribución de analito. Un ejemplo bien conocido es muestras preparadas con la matriz MALDI (DHB) ácida 2, 5-dihydroxybenzoic. Cuando DHB se cristaliza lentamente bajo ambiente, el grado de incorporación de analito en cristales de la matriz es impredecible, ya que las muestras resultantes muestran morfologías irregulares. Dichas muestras normalmente consisten en grandes cristales aciculares y finos. Cuando DHB es preparado usando un disolvente volátil o una placa de la muestra calentada, un secado rápido resulta en cristales finos más homogéneos y mejor resultados cuantitativos8,9,10. Esta técnica se conoce como "recristalización" de muestras MALDI. La mejora se atribuye a la mejor incorporación de analitos en cristales finos matriz durante el proceso de cristalización rápida. También hemos demostrado que ajustar el ambiente de preparación de la muestra reduce la heterogeneidad de la señal de hidratos de carbono y mejores resultados cuantitativos11,12. Los resultados en estos trabajos sugieren que la morfología de la muestra es un factor crítico en la determinación de calidad de la señal de hidratos de carbono. Para desarrollar una estrategia general para el análisis diario, se requiere un método de reforma muestra eficiente proporcionando carbohidratos mayor sensibilidad.
Sistemáticamente hemos examinado la correlación entre la sensibilidad morfología y carbohidratos muestra en MALDI-MS en un reciente informe13. Los resultados obtenidos utilizando varios carbohidratos importantes y mostrar matrices que el mejor realce de la señal se ha cumplido por recristalización secado muestras MALDI. La morfología de muestras preparadas con el método de la gota seca convencional (DD) es reformada por recristalización rápida con metanol (MeOH). Los protocolos de preparación de la muestra detallada se demuestran aquí. El protocolo consta de tres pasos principales, incluyendo muestra placa preacondicionamiento, deposición de la muestra recristalización y análisis de espectrometría de masas. Los hidratos de carbono utilizados incluyen sialil-lewis (SLeA) y maltoheptaose (MH). DHB se utiliza como una matriz de modelo. Los resultados muestran que los carbohidratos señal intensidad y distribución espacial mejoraron marcado después de la recristalización. Este método puede aplicarse a muestras con otras matrices populares, 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) y α- ciano-4-hidroxicinámico el ácido. Este método sirve como un enfoque general que se puede integrar fácilmente en la rutina de laboratorio para el análisis de hidratos de carbono.

<table><tbody><tr><td><Reactivo fuerte></detergente ></td><td></td><td></td><td></td>fuerte</tr> <tr>en <td>polvo</td><td>Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11459</td><td></td></tr><tr><td>sialyl-lewis A (SLeA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1782</td><td></td></tr><tr><td>Maltoheptaose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7753</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q sistema de purificación de agua</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo sin polvo</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 600 mL</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Delta</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>Higrómetro</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Caudalímetro de gas nitrógeno</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>Termopares tipo K</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Scientific Industries</td><td>&nbsp; SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de secado de temperatura controlable</td><td>Este</td> laboratorio <td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraflex II TOF/TOF espectrómetro de masas</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTP 384 placa de objetivo de acero pulido BC</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8280781</td><td></td></tr><tr><td>Flexcontrol Versión 3.4</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Software de control</td></tr><tr><td>Fleximaging Versión 2.1</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Software de imagen</td></tr><tr><td>Flexanalysis Versión 3.4</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Software de análisis</td></tr></tbody></table>

un método de preparación de muestra eficiente para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Preparación de la muestra es un proceso crítico en el análisis de espectrometría de masas (MS) de hidratos de carbono. Aunque la desorción/ionización del laser asistida por matriz (MALDI) MS es el método de elección en el análisis de hidratos de carbono, reproducibilidad de datos y señal pobre ion de muestras de hidratos de carbono siguen siendo problemas graves. Para el análisis cuantitativo de hidratos de carbono, es necesario un protocolo analítico eficaz proporcionando datos de superior calidad. Este video muestra los protocolos de preparación de muestra para mejorar la intensidad de la señal y minimizar la variación de datos de los carbohidratos en MALDI-MS. Después de secado y cristalización de las gotas de la muestra, la morfología cristalina es reformada por el metanol antes de análisis de espectrometría de masa. La mejora en la señal de hidratos de carbono se examina con MALDI imaging espectrometría de masas (IMS). Resultados experimentales demuestran que la reforma de cristal ajusta estructuras cristalinas y redistribuye analitos de hidratos de carbono. En comparación con el método de preparación de gotas secas en MALDI-MS convencionales, reforma morfologías de cristal de hidratos de carbono con metanol muestra intensidad de señal significativamente mejor, ion imagen distribución y estabilidad de los datos. Puesto que los protocolos demostrados en este documento no implican cambios en la composición de la muestra, que son generalmente aplicables a diversos hidratos de carbono y matrices.

Imágenes representativas de la SEM de SLeA mezclan con DHB con DD y métodos de la recristalización se muestran en la figura 1. Una morfología típica de DHB, preparado por el método DD es grandes cristales en forma de aguja en el borde y fina estructura cristalina en el centro de puntos de muestra. Las longitudes típicas de tales cristales en forma de aguja son ~ 100 μm. Después de la recristalización por MeOH, la muestra tiene un área más grande cu...

Se demuestra un protocolo para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas MALDI por reformar estructuras cristalinas durante los procesos de preparación de muestra.

Un método de preparación de muestra eficiente para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Se desarrolló un procedimiento simple de preparación de muestras para mejorar el método convencional en la espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz mediante la reforma de la morfología simple durante el proceso de secado. La ventaja de esta técnica es que la intensidad de la señal de las muestras de carbohidratos preparadas por este método optimizado se puede mejorar de manera efectiva. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el paso de despresurización del metanol es muy crucial y debe realizarse de una sola vez.Cualquier vacilación disminuirá la calidad de los datos. Para comenzar, mientras usa guantes de nitrilo, use 100 mililitros de solución de detergente para lavar a mano la placa de muestra. Use agua destilada desionizada, o DD, para lavar a mano el plato.Luego, con 30 mililitros de metanol, enjuague su superficie. Inserte la placa de muestra en un vaso de precipitados de 600 mililitros y llénela con agua DD hasta que la placa esté completamente sumergida. A continuación, coloque el vaso de precipitados en un baño ultrasónico y sonique la placa durante 15 minutos.Retire la placa de muestra del vaso de precipitados y use nitrógeno presurizado para soplar las gotas de agua. A continuación, deposite 0,2 microlitros de metanol en la placa de muestra para comprobar si se propaga a otros puntos. Si es así, repita el lavado, la sonicación y el tratamiento con nitrógeno como se acaba de demostrar.Después de preparar la cámara de secado de acuerdo con el protocolo de texto, premezcle 0,25 microlitros de solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico y 0,25 microlitros de solución de Sialyl-Lewis A o maltoheptosa, en el tubo de microcentrífuga. A continuación, agita el tubo durante tres segundos. Gire la solución mezclada en la mini centrífuga a 2000 veces G durante dos segundos.A continuación, pipetee inmediatamente 0,1 microlitros de la solución premezclada en la placa de muestra. Cuando la muestra se haya secado, mientras se trabaja rápidamente para evitar la evaporación, pipetee 0,2 microlitros de metanol directamente sobre el punto de muestra. La muestra se volverá a disolver y luego se secará inmediatamente.La etapa de deposición de metanol es la etapa más difícil que determina la calidad y la reproducibilidad de los datos. Para garantizar el mejor rendimiento, recomendamos que el usuario termine la deposición en tres a cinco segundos para evitar una pérdida significativa de metanol por evaporación. Use guantes de nitrilo y retire con cuidado la placa de muestra de la cámara de secado.Luego, bajo un microscopio, examine la muestra. Si las morfologías de los cristales no son las esperadas, repita la mezcla de la muestra y las manchas en la placa de muestra. Para asegurarse de que los cristales de muestra tengan la morfología óptima después de la recristalización, utilice siempre un microscopio para examinarlos.Es difícil determinar correctamente la calidad de la morfología del cristal a simple vista. Para analizar una muestra de un microlitro, premezcle 2,5 microlitros de solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico y 2,5 microlitros de solución de Sialyl-Lewis A o maltoheptaose en un tubo de microcentrífuga. Agite la solución premezclada durante cinco segundos.Centrifugar la solución mezclada a 2000 veces G durante dos segundos y, a continuación, pipetear inmediatamente un microlitro de la solución premezclada en la placa de muestra. Una vez que la muestra se seque, pipetee 1,5 microlitros de metanol directamente sobre el punto de muestra seco. La muestra se volverá a disolver y se secará inmediatamente.Retire con cuidado la muestra de la cámara de secado. Examine la muestra bajo un microscopio. Si las morfologías de los cristales no son las esperadas, repita la preparación de la solución como se acaba de demostrar.Para llevar a cabo la espectrometría de masas, abra el software de control del espectrómetro de masas e inserte la placa de muestra en la máquina. Seleccione el método de adquisición de datos preoptimizado en el software, luego, utilizando el software de imágenes, registre toda la región de la muestra para obtener imágenes de espectrometría de masas. Inicie la adquisición de datos en modo por lotes del software de control.Una vez completada la adquisición de datos, utilice el software de imágenes para trazar las imágenes de iones y analizar los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Aquí se muestran imágenes SEM representativas de Sialyl-Lewis A mezclado con ácido 2,5-dihidroxibenzoico preparadas utilizando gotas secas y métodos de recristalización. Una morfología típica del ácido 2,5-dihidroxibenzoico es de grandes cristales en forma de aguja en el borde y finas estructuras cristalinas en el centro de las manchas de muestra.Después de la recristalización por metanol, la muestra tiene un área más grande cubierta uniformemente con cristales finos en forma de escamas. Esta figura muestra los resultados de la espectrometría de masas de Sialyl-Lewis A y maltoheptacosa con y sin recristalización de metanol. Después de la recristalización, la distribución de las señales de Sialyl-Lewis A y maltohepaose coincide bien con las imágenes de campo claro de los puntos de muestreo.Las intensidades de señal de las muestras de carbohidratos recristalizados también mejoran en comparación con las muestras convencionales de gotas secas. Este gráfico compara la intensidad de la señal de los carbohidratos en modo de iones sodiados o positivos y de los carbohidratos en modo de iones desprotónicos o negativos de muestras recristalizadas con respecto a la de las muestras de gotas secas. En promedio, la recristalización de las muestras de Sialyl-Lewis A y maltoheptosa aumentó las señales sodiadas en factores de 3,9 y 3,3.Las señales de iones iónicos Sialil-Lewis A desprotonados se incrementaron en un factor de 4,7 después de la recristalización. Una vez dominadas, las muestras se pueden preparar en 10 minutos utilizando esta técnica si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante que la gota de metanol se deposite de forma inmediata y precisa en el lugar de la muestra.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo controlar de manera efectiva la morfología cristalina de múltiples muestras para obtener las mejores señales de iones para el análisis de rutina.

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