Un método de preparación de muestra eficiente para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz

Se desarrolló un procedimiento simple de preparación de muestras para mejorar el método convencional en la espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz mediante la reforma de la morfología simple durante el proceso de secado. La ventaja de esta técnica es que la intensidad de la señal de las muestras de carbohidratos preparadas por este método optimizado se puede mejorar de manera efectiva. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el paso de despresurización del metanol es muy crucial y debe realizarse de una sola vez.

Cualquier vacilación disminuirá la calidad de los datos. Para comenzar, mientras usa guantes de nitrilo, use 100 mililitros de solución de detergente para lavar a mano la placa de muestra. Use agua destilada desionizada, o DD, para lavar a mano el plato.

Luego, con 30 mililitros de metanol, enjuague su superficie. Inserte la placa de muestra en un vaso de precipitados de 600 mililitros y llénela con agua DD hasta que la placa esté completamente sumergida. A continuación, coloque el vaso de precipitados en un baño ultrasónico y sonique la placa durante 15 minutos.

Retire la placa de muestra del vaso de precipitados y use nitrógeno presurizado para soplar las gotas de agua. A continuación, deposite 0,2 microlitros de metanol en la placa de muestra para comprobar si se propaga a otros puntos. Si es así, repita el lavado, la sonicación y el tratamiento con nitrógeno como se acaba de demostrar.

Después de preparar la cámara de secado de acuerdo con el protocolo de texto, premezcle 0,25 microlitros de solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico y 0,25 microlitros de solución de Sialyl-Lewis A o maltoheptosa, en el tubo de microcentrífuga. A continuación, agita el tubo durante tres segundos. Gire la solución mezclada en la mini centrífuga a 2000 veces G durante dos segundos.

A continuación, pipetee inmediatamente 0,1 microlitros de la solución premezclada en la placa de muestra. Cuando la muestra se haya secado, mientras se trabaja rápidamente para evitar la evaporación, pipetee 0,2 microlitros de metanol directamente sobre el punto de muestra. La muestra se volverá a disolver y luego se secará inmediatamente.

La etapa de deposición de metanol es la etapa más difícil que determina la calidad y la reproducibilidad de los datos. Para garantizar el mejor rendimiento, recomendamos que el usuario termine la deposición en tres a cinco segundos para evitar una pérdida significativa de metanol por evaporación. Use guantes de nitrilo y retire con cuidado la placa de muestra de la cámara de secado.

Luego, bajo un microscopio, examine la muestra. Si las morfologías de los cristales no son las esperadas, repita la mezcla de la muestra y las manchas en la placa de muestra. Para asegurarse de que los cristales de muestra tengan la morfología óptima después de la recristalización, utilice siempre un microscopio para examinarlos.

Es difícil determinar correctamente la calidad de la morfología del cristal a simple vista. Para analizar una muestra de un microlitro, premezcle 2,5 microlitros de solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico y 2,5 microlitros de solución de Sialyl-Lewis A o maltoheptaose en un tubo de microcentrífuga. Agite la solución premezclada durante cinco segundos.

Centrifugar la solución mezclada a 2000 veces G durante dos segundos y, a continuación, pipetear inmediatamente un microlitro de la solución premezclada en la placa de muestra. Una vez que la muestra se seque, pipetee 1,5 microlitros de metanol directamente sobre el punto de muestra seco. La muestra se volverá a disolver y se secará inmediatamente.

Retire con cuidado la muestra de la cámara de secado. Examine la muestra bajo un microscopio. Si las morfologías de los cristales no son las esperadas, repita la preparación de la solución como se acaba de demostrar.

Para llevar a cabo la espectrometría de masas, abra el software de control del espectrómetro de masas e inserte la placa de muestra en la máquina. Seleccione el método de adquisición de datos preoptimizado en el software, luego, utilizando el software de imágenes, registre toda la región de la muestra para obtener imágenes de espectrometría de masas. Inicie la adquisición de datos en modo por lotes del software de control.

Una vez completada la adquisición de datos, utilice el software de imágenes para trazar las imágenes de iones y analizar los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Aquí se muestran imágenes SEM representativas de Sialyl-Lewis A mezclado con ácido 2,5-dihidroxibenzoico preparadas utilizando gotas secas y métodos de recristalización. Una morfología típica del ácido 2,5-dihidroxibenzoico es de grandes cristales en forma de aguja en el borde y finas estructuras cristalinas en el centro de las manchas de muestra.

Después de la recristalización por metanol, la muestra tiene un área más grande cubierta uniformemente con cristales finos en forma de escamas. Esta figura muestra los resultados de la espectrometría de masas de Sialyl-Lewis A y maltoheptacosa con y sin recristalización de metanol. Después de la recristalización, la distribución de las señales de Sialyl-Lewis A y maltohepaose coincide bien con las imágenes de campo claro de los puntos de muestreo.

Las intensidades de señal de las muestras de carbohidratos recristalizados también mejoran en comparación con las muestras convencionales de gotas secas. Este gráfico compara la intensidad de la señal de los carbohidratos en modo de iones sodiados o positivos y de los carbohidratos en modo de iones desprotónicos o negativos de muestras recristalizadas con respecto a la de las muestras de gotas secas. En promedio, la recristalización de las muestras de Sialyl-Lewis A y maltoheptosa aumentó las señales sodiadas en factores de 3,9 y 3,3.

Las señales de iones iónicos Sialil-Lewis A desprotonados se incrementaron en un factor de 4,7 después de la recristalización. Una vez dominadas, las muestras se pueden preparar en 10 minutos utilizando esta técnica si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante que la gota de metanol se deposite de forma inmediata y precisa en el lugar de la muestra.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo controlar de manera efectiva la morfología cristalina de múltiples muestras para obtener las mejores señales de iones para el análisis de rutina.