PCR de bloqueo de tipo salvaje para detectar mutaciones somáticas de baja frecuencia

La reacción en cadena de la polimerasa bloqueadora de tipo salvaje, o WTB-PCR, detecta mutaciones puntuales amplificando selectivamente alelos mutantes de baja abundancia mientras inhibe la amplificación de alelos de tipo salvaje de alta abundancia en muestras de ADN.

WTB-PCR utiliza ácidos nucleicos bloqueados, o oligonucleótidos modificados monocatenarios que contienen LNA, complementarios a la hebra de ADN de tipo salvaje de la muestra que se une específicamente a la hebra complementaria. La unión al LNA bloquea la actividad de la ADN polimerasa e inhibe el alargamiento del ADN molde de tipo salvaje.

Para realizar WTB-PCR, tome una mezcla maestra que contenga dNTP, LNA y cebadores directos e inversos específicos del objetivo en agua destilada sin nucleasas.

Agregue una solución termoestable que contenga ADN polimerasa al tubo y pipetee la mezcla en el pocillo de una placa de PCR. Agregue la muestra de ADN genómico que contiene ADN mutante y de tipo salvaje en el pozo y comience la PCR.

Durante la PCR, la desnaturalización mediada por alta temperatura separa los ADN bicatenarios. Las hebras separadas actúan como plantillas para que los cebadores se recocieron, mientras que el LNA se une a su hebra complementaria de ADN de tipo salvaje y forma el híbrido de ADN de tipo salvaje bloqueador. A una temperatura más alta, la ADN polimerasa agrega dNTP y extiende las plantillas de ADN del cebador.

Una temperatura de fusión más alta del híbrido LNA-ADN que el complejo ADN-ADN lo mantiene intacto. La modificación del LNA finalmente impide que la ADN polimerasa extienda el híbrido LNA-ADN, lo que inhibe su alargamiento.

Durante varios ciclos de PCR, el bloqueo mediado por LNA aumenta el número de amplicones de tipo mutante en relación con su variante de tipo salvaje en la muestra, lo que ayuda a su detección selectiva.

Los cebadores directos e inversos se diseñaron con una secuencia 5'-M13 para permitir el recocido de cebadores de secuenciación complementarios. Diseñe el oligonucleótido de bloqueo para que tenga aproximadamente de 10 a 15 bases de longitud y sea complementario a la plantilla de tipo salvaje donde se desea el enriquecimiento mutante.

Un oligo más corto mejorará la discriminación por desajustes. Para lograr una alta especificidad del objetivo, es importante no usar demasiados nucleótidos de bloqueo, ya que esto dará como resultado un oligonucleótido muy "pegajoso".

Para diseñar el oligonucleótido de bloqueo, comience navegando al sitio web de Oligo Tools. Seleccione la herramienta "Predicción de oligo _{T M}". Se abrirá una nueva ventana. Pegue la secuencia de la plantilla de tipo salvaje que se bloqueará en el cuadro "Secuencia de oligo". Agregue un signo más delante de las bases de bloqueo para marcarlas. Haga clic en el botón "Calcular" para determinar el T_M aproximado del híbrido bloqueador de ADN. Las temperaturas de fusión calculadas aparecerán en los cuadros a continuación.

Diseñe el oligo de bloqueo para que tenga una temperatura de fusión de 10 a 15 grados Celsius por encima de la temperatura de extensión durante el termociclado. Aquí, la temperatura de extensión es de 72 grados centígrados. Para ajustar la temperatura de fusión, agregue, retire o sustituya las bases de bloqueo. Evite largos tramos de tres a cuatro bases C o G de bloqueo.

A continuación, para evitar la formación de estructuras secundarias o la autodimerización, regrese a la pantalla de inicio del sitio web de Oligo Tools y seleccione la herramienta "Oligo Optimizer". Se abrirá una nueva ventana. Pegue la secuencia de la plantilla de tipo comodín que se va a bloquear en el cuadro. Agregue un signo más para indicar bases de bloqueo. Seleccione las dos casillas para "Estructura secundaria" y "Solo para uno mismo" y presione el botón "Analizar" para ver los puntajes de hibridación y estructura secundaria.

Estas puntuaciones representan estimaciones muy aproximadas de las temperaturas de fusión de los autodímeros y las estructuras secundarias, respectivamente. Las puntuaciones más bajas son óptimas y se pueden lograr limitando el emparejamiento bloqueador-bloqueador. Eliminar o reposicionar los nucleótidos bloqueadores para lograr puntuaciones más bajas. El oligonucleótido de bloqueo optimizado para MyD88, que se muestra aquí, logra un equilibrio entre la temperatura de fusión del híbrido bloqueador de ADN y las puntuaciones de hibridación y estructura secundaria lo suficientemente bajas.

Fue diseñado para cubrir los aminoácidos Q262 a I266 y presenta un dT invertido 3' para inhibir tanto la extensión por la ADN polimerasa como la degradación por la 3'-exonucleasa. Una vez diseñados los cebadores, configure la PCR de bloqueo de tipo salvaje y realice el termociclado, como se describe en el documento adjunto.