PCR de bloqueo de tipo salvaje para detectar mutaciones somáticas de baja frecuencia

La reacción en cadena de la polimerasa bloqueadora de tipo salvaje, o WTB-PCR, detecta mutaciones puntuales amplificando selectivamente alelos mutantes de baja abundancia mientras inhibe la amplificación de alelos de tipo salvaje de alta abundancia en muestras de ADN.

WTB-PCR utiliza ácidos nucleicos bloqueados, o oligonucleótidos modificados monocatenarios que contienen LNA, complementarios a la hebra de ADN de tipo salvaje de la muestra que se une específicamente a la hebra complementaria. La unión al LNA bloquea la actividad de la ADN polimerasa e inhibe el alargamiento del ADN molde de tipo salvaje.

Para realizar WTB-PCR, tome una mezcla maestra que contenga dNTP, LNA y cebadores directos e inversos específicos del objetivo en agua destilada sin nucleasas.

Agregue una solución termoestable que contenga ADN polimerasa al tubo y pipetee la mezcla en el pocillo de una placa de PCR. Agregue la muestra de ADN genómico que contiene ADN mutante y de tipo salvaje en el pozo y comience la PCR.

Durante la PCR, la desnaturalización mediada por alta temperatura separa los ADN bicatenarios. Las hebras separadas actúan como plantillas para que los cebadores se recocieron, mientras que el LNA