Cuantificación de la formación de ondulaciones en la membrana mediante microscopía electrónica de barrido

Los estimuladores externos activan las células e inducen la protuberancia tridimensional de la membrana circular, o la formación de volantes de membrana, esenciales para diversas actividades celulares.

Para visualizar la formación de volantes de membrana, comience con una placa de pocillos múltiples que contenga un cubreobjetos en la base. La parte superior del cubreobjetos tiene macrófagos cultivados.

Tratar estos macrófagos con moléculas estimuladoras que activan las células, facilitando la reorganización del citoesqueleto y la formación de protuberancias de membrana. Superponga las células con una solución fijadora, reticulando las proteínas y preservando la estructura celular.

Trate los macrófagos fijos con concentraciones crecientes de alcohol para una deshidratación completa. Deseque estos macrófagos con un secador de punto crítico, eliminando cualquier rastro de agua para obtener mejores imágenes.

Monte el cubreobjetos en un portamuestras de microscopía electrónica de barrido o SEM con cinta conductora. La pulverización catódica recubre el cubreobjetos que contiene macrófagos con una fina capa de metal, lo que garantiza una buena conductividad electrónica durante la obtención de imágenes.

Coloque el cubreobjetos en la cámara SEM. Enfoca el haz de electrones en el cubreobjetos. El haz de electrones golpea la membrana del macrófago recubierto de metal, provocando la generación de electrones secundarios de baja energía desde la superficie de la membrana.

Las protuberancias tridimensionales dispersan los electrones de manera diferente al resto de la membrana, destacando estas características en la superficie celular. El detector recoge los electrones dispersos de varias regiones de la superficie celular, generando una imagen de contraste.

En la imagen SEM, los macrófagos aparecen más oscuros con protuberancias circulares brillantes en la superficie, lo que confirma la formación de volantes.

Comience colocando cubreobjetos de vidrio estériles en los pocillos de una placa de 24 pocillos con fórceps esterilizados en autoclave. Luego, siembre macrófagos RAW 264.7 en los cubreobjetos a una densidad de 10⁶ células por mililitro, e incube la placa durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Al día siguiente, reemplace el medio en cada pocillo con 500 microlitros de medio completo fresco, luego, trate previamente los macrófagos durante 30 minutos con un control de vehículo como DMSO o un inhibidor de macropinocitosis como EIPA. A continuación, para promover la ondulación de la membrana, trate las células durante 30 minutos con estimuladores de macropinocitosis, como una solución de PMA de 1 micromolar o 100 nanogramos por mililitro de factor estimulante de colonias de macrófagos.

Para fijar las células para la microscopía electrónica de barrido, aspire el medio de los pocillos y lave los cubreobjetos dos veces con PBS helado. Luego, incube los cubreobjetos en un fijador durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de una incubación nocturna a 4 grados centígrados.

Al día siguiente, sin alterar la monocapa celular, lave suavemente y luego incube los cubreobjetos en 500 microlitros de cacodilato de sodio 0,1 molar durante 15 minutos. Después de dos lavados con 500 microlitros de agua destilada, lave los cubreobjetos dos veces en 500 microlitros de una serie de etanol graduada con una incubación de 10 minutos en cada lavado.

Para realizar el secado de puntos críticos, coloque los cubreobjetos en un secador de puntos críticos y cúbralos con etanol al 100%, luego presione el botón de encendido y abra el tanque de dióxido de carbono. Presione el botón Enfriar durante aproximadamente 30 segundos hasta que la temperatura disminuya a 0 grados centígrados. Luego, presione el botón Llenar hasta que aparezca una burbuja en la ventana de la cámara.

A continuación, presione el botón de purga hasta que desaparezca el olor a etanol del escape de purga. Luego, presione el botón Enfriar nuevamente, hasta que la temperatura disminuya a 0 grados centígrados. Vuelva a presionar los botones Rellenar y Purgar para desactivarlos. Luego, cierre el tanque de dióxido de carbono. Vuelva a presionar el botón Enfriar para apagarlo, luego presione el botón Calor. Ajuste la temperatura a 42 grados Celsius y la presión a 1,200 libras por pulgada cuadrada.

Una vez que la presión y la temperatura se estabilicen, presione el botón Purgar para permitir que la presión disminuya lentamente. Una vez que la presión de la cámara alcance las 150 libras por pulgada cuadrada, presione el botón Vent y espere hasta que la presión disminuya a 0 libras por pulgada cuadrada. Apague el secador de punto crítico y retire los cubreobjetos.

A continuación, con las lengüetas adhesivas de carbono, monte los cubreobjetos en los soportes de muestras de aluminio para microscopía electrónica de barrido. Luego, proceda al recubrimiento por pulverización catódica con oro o paladio en un recubridor por pulverización catódica.

Encienda el botón de encendido de la máquina de recubrimiento por pulverización catódica. Después de que el vacío alcance los 30 militorrs, enjuague la cámara para eliminar la humedad y el aire apagando el interruptor de gas y girando la válvula de gas fino en sentido antihorario. Una vez que el vacío aumente a 200 militorrs, apague el interruptor de gas y espere hasta que el vacío alcance los 30 militorrs, luego, enjuague la cámara nuevamente para eliminar la humedad y el aire como se demuestra. Después de enjuagar la cámara tres veces, presione el botón del temporizador y ajuste la perilla de voltaje hasta que el medidor marque 10 miliamperios. Luego, retire los cubreobjetos recubiertos de la cámara.

Para visualizar y cuantificar los volantes de la membrana, inserte los cubreobjetos de muestra en la cámara de un microscopio electrónico de barrido. Cierre la puerta y presione el botón de evacuación. Abra el software de funcionamiento del microscopio y ajuste el voltaje de aceleración a 15 kilovoltios y la distancia de trabajo a 10 milímetros. Presione el botón Coordenadas y muévase por el controlador hasta que las celdas aparezcan en el centro de la pantalla de observación. Establezca el aumento en 3500x y obtenga una imagen de la muestra haciendo clic en el botón Foto.