Aislamiento de células T basado en flotación mediante clasificación de células activadas por flotabilidad

Para aislar las células T, glóbulos blancos esenciales para el sistema inmunológico, mediante la clasificación de células activadas por flotabilidad, BACS, tome una suspensión de células mononucleares de sangre periférica, PBMC. Las PBMC contienen células T diana y células no diana como células B, monocitos, células asesinas naturales y células dendríticas.

Agregue un tampón que contenga una cantidad adecuada de anticuerpo anti-CD3 biotinilado e incube durante el tiempo requerido. El anticuerpo se une al complejo CD3, un complejo de proteínas multiméricas en la superficie celular, una característica definitoria de las células T.

Agregue microburbujas funcionalizadas (pequeñas partículas esféricas recubiertas con estreptavidina) para una selección positiva de células T unidas a anticuerpos. El núcleo de cada microburbuja es una esfera hueca, lo que las convierte en partículas de baja densidad capaces de flotar en una solución acuosa.

Incube la mezcla bajo agitación, permitiendo que las microburbujas y la muestra se mezclen bien. Durante la incubación, la estreptavidina en la microburbuja se une a la biotina en el anticuerpo unido a las células T, inmovilizando las células en las microburbujas.

Centrifugar el tubo. Las células no diana se separan de la mezcla como un gránulo en la parte inferior.

Las microburbujas unidas a las células T diana permanecen a flote en la superficie, lo que lleva a la separación de las células T basada en la flotabilidad. Esta técnica de separación limita el estrés en las células diana. Con una pipeta fina, retire el gránulo y el subnadante sin alterar la capa de microburbujas.

Vuelva a suspender las células T aisladas unidas a microburbujas en un medio de cultivo apropiado para su posterior procesamiento.

Para comenzar, incube 3 x 10⁸ PBMC obtenidos comercialmente en 2,5 mililitros de tampón de separación con anticuerpo anti-CD3 biotinilado. Mezcle suavemente los componentes pipeteando e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Agregue microburbujas de estreptavidina a las células en una proporción de 0.5 a 1, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y mezcle usando un rotador comercial de extremo a extremo a 20 RPM durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, las células seleccionadas positivamente estarán en la parte superior de la suspensión con las microburbujas de estreptavidina, y las células restantes no seleccionadas estarán en el sedimento de células en la parte inferior del tubo.

Con una pipeta de vidrio de 9 pulgadas, inserte la punta debajo de la capa de células de burbujas hasta el fondo del tubo. Aspire el gránulo celular y el subnadante con una pipeta electrónica y transfiéralos a un nuevo tubo.

Vuelva a suspender la capa de células de burbujas que queda en el tubo original en 1 mililitro de medio de células T completo. Centrifugar el subnadante a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y utilizarlo para la medición indirecta de la pureza y la recuperación.