Visualización de la activación de caspasas en macrófagos derivados de monocitos humanos

En las células inmunitarias, la caspasa-1, una caspasa inflamatoria, es un componente clave que responde al sistema inmunitario y que existe en forma inactiva. Estas formas inactivas consisten en un prodominio fusionado con un dominio catalítico y se activan a través de la dimerización inducida por proximidad.

Para visualizar la activación de las caspasas in vivo, comience con un cultivo de macrófagos derivados de monocitos humanos transfectados que expresan proteínas fluorescentes rojas y un par de proteínas reporteras de complementación fluorescentes. Las proteínas reporteras contienen un prodominio de caspasa-1 fusionado con fragmentos no fluorescentes de la proteína Venus, ya sea Venus-N o Venus-C.

Trate las células con un medio de imagen que contenga lipopolisacáridos, un estimulante inflamatorio derivado de bacterias, e ionóforos de potasio, nigericina.

Los lipopolisacáridos interactúan con los receptores de reconocimiento de patrones en el macrófago, iniciando el ensamblaje de un complejo inflamatorio.

Las moléculas de nigericina ingresan a la célula y se unen a los iones de potasio, lo que provoca su salida al medio extracelular y disminuye la concentración de iones de potasio intracelular. Esto conduce al cebado de las proteínas sensoras del inflamasoma con proteínas adaptadoras, una proteína puente entre la proteína sensora y la procaspasa-1, formando el complejo.

Los prodominios que contienen fragmentos de Venus interactúan con las proteínas adaptadoras del complejo. Esto hace que los dos fragmentos estén cerca, obligándolos a plegarse y emitir fluorescencia.

Visualice las células bajo un microscopio de epifluorescencia.

Las células transfectadas aparecen rojas con manchas de fluorescencia verdes, lo que confirma la activación de las caspasas.

Tome un microtubo estéril de 1,5 mililitros por transfección y agregue el plásmido indicador apropiado y los plásmidos de caspasa-BiFC en la campana. Coloque la estación de pipetas, el dispositivo, las puntas, los tubos de electroporación y la pipeta en una campana de flujo laminar estéril. Conecte y encienda el dispositivo de nucleofección.

Introduzca los parámetros de transfección en la pantalla de inicio que se muestra. Presione Voltaje, ingrese 1,000 y presione Listo para configurarlo en 1000 voltios. Presione Ancho, ingrese 40 y presione Listo para establecer el pulso en 40 milisegundos. Por último, presione # Pulsos, ingrese dos y presione Listo para establecer el número de pulsos eléctricos en 2.

Tome uno de los tubos de electroporación y llénelo con tres mililitros de tampón electrolítico E a temperatura ambiente. Inserte el tubo de electroporación en el soporte de pipetas de la estación de pipetas, asegurándose de que el electrodo en el costado del tubo esté hacia adentro y que se escuche un clic cuando se inserte el tubo.

Tome el gránulo celular y agregue 10 microlitros de tampón R de resuspensión precalentado por cada 1 a 2 veces 10 a las quintas celdas, y mezcle suavemente con una micropipeta P20. Agregue 10 microlitros de la suspensión celular a cada tubo de transfección y mezcle suavemente con una micropipeta P20. Inserte una punta en la pipeta presionando el botón pulsador hasta el segundo tope, asegurándose de que la abrazadera recoja completamente el vástago de montaje del pistón en la punta.

A continuación, presione el botón pulsador de la pipeta hasta el primer tope y sumérjalo en el primer tubo que contiene la mezcla de ADN celular o plásmido para aspirar la muestra. Inserte la pipeta con la muestra con mucho cuidado en el soporte de la pipeta, asegurándose de que la pipeta haga clic y esté colocada correctamente. Presione Inicio en la pantalla táctil y espere hasta que se entreguen los pulsos eléctricos.

Retire lentamente la pipeta de la estación y añada inmediatamente la suspensión celular transfectada en el pocillo correspondiente con el medio precalentado y sin antibióticos pulsando lentamente el botón pulsador hasta el primer tope. Agite suavemente la placa con células transfectadas e incube durante una a tres horas en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada. Luego, agregue 200 microlitros de medio de cultivo precalentado a cada pocillo.

Coloque el plato en la incubadora y espere al menos 24 horas para la expresión génica. Al día siguiente, inspeccione la viabilidad celular y la eficiencia de transfección con un microscopio de epifluorescencia.

Retire el medio de las células con cuidado con una micropipeta P1000 y agregue 500 microlitros de la solución de estímulo por el costado del pocillo. Para ejecutar pocillos de control no tratados, agregue un medio de imagen sin el estímulo.

Para visualizar las células con un microscopio de epifluorescencia o confocal, encienda el microscopio y la fuente de luz fluorescente, siguiendo las instrucciones del fabricante. Seleccione el objetivo de 10 o 20 veces y coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio.

Encuentre células bajo el filtro de 568 nanómetros con el ocular y concéntrese en las células que expresan los glóbulos rojos reporteros. Cuente todos los glóbulos rojos en el campo visual. Mientras estás en el mismo campo visual, cambia a los filtros 488 o 512. Cuenta el número de glóbulos rojos que también son verdes. Cuente al menos 100 glóbulos rojos de un mínimo de tres campos.