Name: Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprende a aislar monocitos humanos por centrifugación en gradiente de densidad doble y diferenciarlos a macrófagos en bolsas de cultivo recubiertas de teflón. Este método eficiente utiliza equipos de laboratorio estándar.

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Los autores desean agradecer a la señora Meike Schaffrinski por su siempre excelente asistencia técnica durante los últimos años. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación Alemana (DFG) dentro del grupo de investigación conjunta 942 (FOR942) y por el Programa de Investigación de la Facultad de Medicina de la Georg-August-Universität Göttingen.

1 Preparación de suero AB humano estéril <ol><li> Recoger 4-5 bolsas de plasma fresco congelado (FFP). Hasta que se hayan recogido las bolsas de las tiendas a -20 ° C suficientes bolsas. </li><li> Descongele las bolsas y se incuba durante 30 min a 56 ° C en un baño de agua para inactivar el complemento y eliminar la fibrina. </li><li> Desinfectar bien el exterior de las bolsas y transferir el plasma a tubos de 50 ml. </li><li> Se centrifuga a 3.000 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente para deshacerse de precipitados y plaquetas residuales. </li><li> Piscina todo sobrenadantes y deseche los pellets. </li><li> Muestras de suero alícuota en tubos de 15 ml y almacenar a -20 ° C. NOTA: Alternativamente, disponible comercialmente normal de suero AB humano inactivado por calor puede ser utilizado. </li></ol> 2. Aislamiento de monocitos Para facilitar el equilibrio de la centrífuga, se recomienda procesar dos capas leucocitarias en paralelo. Sin embargo, tomar cavolver a utilizar materiales separados para cada donante y no mezclar las células. En el caso de capas leucocitarias no se pueden obtener fácilmente, 400 ml de sangre periférica heparinizada se pueden utilizar en su lugar. <ol><li> Desinfectar con cuidado las bolsas de plástico que contienen las capas leucocitarias y transferir el contenido de cada capa leucocitaria de dos tubos de 50 ml. </li><li> Para cada capa leucocitaria llenar tres tubos de 50 ml con 15 ml de solución de Ficoll (1,077 g / ml). El Ficoll debe estar a temperatura ambiente para la preparación. </li><li> Capa de 30-35 ml de la capa leucocitaria de sangre en la parte superior de la solución de Ficoll para la primera gradiente de densidad. Tenga cuidado al hacer esto lentamente y con cuidado a fin de evitar que se mezclen ambas capas. </li><li> Centrifugar a 400 xg sin freno durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recoger el anillo blanco de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) que está situado entre las dos fases con una pipeta Pasteur de plástico y la transferencia a un tubo de 50 ml. </li><li> Llenar cada tubo con PBS-EDTA (1 mM) hasta 40 ml en total. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min sin freno a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lavar pellet de nuevo con 40 ml de PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Para cada grupo de donantes los gránulos en 20 ml de RPMI-1640 sin rojo de fenol + 10% de FCS. </li><li> Preparar la solución de Percoll iso-osmótica para el segundo gradiente de densidad: Para dos donantes mezclan 23,13 ml de solución de Percoll (densidad: 1,131 g / ml) en un tubo de 50 ml con 1,87 ml de PBS 10 veces. A continuación, transferir 23 ml de esta solución a un nuevo tubo de 50 ml y añadir 27 ml de RPMI-1640 con rojo fenol + FCS al 10% para obtener una solución 46% de Percoll iso-osmótica. El Percoll debe estar a temperatura ambiente para la preparación. </li><li> Para cada donante de transferencia de 25 ml de la solución de Percoll preparada a un tubo de 50 ml y la capa de la solución de PBMC preparado en 2.9) en la parte superior de la solución de Percoll. Tenga cuidado al hacer esto muy lentamente unad cuidadosamente, ambas capas tienden a mezclarse fácilmente. Si se hace correctamente las dos fases se pueden distinguir debido a su diferencia en el color. </li><li> Centrifugar a 550 xg sin freno durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recoger el anillo blanco de los monocitos que se encuentra entre las dos fases con una pipeta Pasteur de plástico y la transferencia a un tubo de 50 ml. </li><li> Llenar cada tubo con PBS-EDTA (1 mM) hasta 50 ml en total. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min sin freno a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 20 ml de RPMI-1640 con rojo fenol + 10% de FCS. </li></ol> 3. diferenciación de los monocitos a macrófagos <ol><li> Determinar el número de monocitos aislados en una dilución 1:10 en azul de tripano. Sólo contar las células grandes, a menudo de forma irregular-, que son los monocitos. No contar las células pequeñas, con forma redonda que son linfocitos. NOTA: Los números de monocitos no se han determinado con precisión demasiado porque sólo dan una pista acerca de cuántos y cuáles recubierto de teflón FEP bolsas (pequeños o grandes) tienen que ser utilizados para la diferenciación de las células. </li><li> Para 1,0-1,5 x 10 8 monocitos a partir de un donante, sembrar las células en una gran bolsa de cultivo celular recubierto de teflón FEP. Para cada bolsa de preparar el medio de cultivo que consiste en 174 ml de RPMI-1640, 2% de suero AB humano (como se ha preparado en la Sección 1), 1% de penicilina / estreptomicina, y 2,5 ng / ml de M-CSF (volumen total: 180 ml). <ol><li> Para 3,0-5,0 x 10 7 monocitos a partir de un donante, sembrar las células en una pequeña bolsa de cultivo celular recubierto de teflón. Para cada bolsa de preparar el medio de cultivo que consiste en 28,5 ml de RPMI-1640, 2% de suero AB humano (como se ha preparado en la Sección 1), 1% de penicilina / estreptomicina, y 2,5 ng / ml de M-CSF (volumen total: 30 ml). NOTA: Si por ejemplo, se obtienen 8,0 x 10 7 monocitos, se recomienda sembrar en two bolsas de menor volumen con 4,0 x 10 7 células cada uno. En lugar de M-CSF, monocitos, alternativamente, se pueden diferenciar con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) a la misma concentración (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Añadir la suspensión celular (20 ml) al medio preparado y mezclar cuidadosamente. Si dos bolsas se preparan a partir de un donante, añadir 20 ml de RPMI-1640 a la suspensión celular y a continuación, añadir la mitad de la suspensión a cada preparación de medio. </li><li> Opcional: Para determinar si la preparación de los monocitos se ha mantenido estéril, al desgarro de una gota de la suspensión de células en una placa de agar sangre e incubar durante la noche a 37 ° C. </li><li> Apriete la vaina de un 50 ml PERFUSOR jeringa en el tapón de la bolsa de cultivo celular recubierto de teflón FEP y llenarlo con la suspensión celular preparada. </li><li> Desconecte la jeringa y empuje el aire que queda fuera de la bolsa. Cierre la bolsa con un cono de cierre. </li><li> Incubar las bolsas durante 6-7 días a 3776; C con 5% de CO 2. </li></ol> 4. macrófagos Harvest <ol><li> Coloque las bolsas recubiertas de Teflon FEP cultivo celular con los macrófagos diferenciados en hielo durante al menos 1 hora para facilitar el desprendimiento de las células (una incubación de hasta 3 horas es posible). Asegúrese de que toda la superficie de la bolsa está cubierto de hielo. </li><li> Tire de la bolsa con una presión mínima de 10x sobre el borde de una mesa / tabla. </li><li> Desinfectar cuidadosamente el exterior de la bolsa y retire el cono de cierre. </li><li> Apretar una jeringa de 50 ml en el enchufe de la bolsa, retire la suspensión de células, y la transfiere a tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min a temperatura ambiente para de girar las células. </li><li> Aspirar el sobrenadante y poner en común las pastillas de una bolsa de 10 ml de RPMI-1640 + 10% FCS en total. </li><li> Determinar el número de células en un hemocitómetro (1: 4-1: 10 de dilución en azul de tripano). Sólo contar las grandes células redondas. NOTA: Después de la diferenciación de los macrófagos en las bolsas recubiertas con Teflon FEP, no puede haber células residuales, por ejemplo, linfocitos, dependiendo del donante y de la calidad del aislamiento de monocitos. </li><li> Para reutilizar las bolsas recubiertos con teflón FEP, lavar dos veces con etanol al 70% para eliminar las células residuales. Llene con 50 ml de etanol al 70% y se incuba durante la noche. Lavar las bolsas 3 veces con PBS estéril, se envuelven en papel de esterilización, y esterilizar en un autoclave utilizando procedimientos estándar. NOTA: Las bolsas de cultivo celular se pueden reutilizar varias veces sin ninguna pérdida en los rendimientos de los macrófagos. Sin embargo, decidimos desechar las bolsas después de 10 usos antes de que empiecen a gotear. </li><li> Para posteriores experimentos de cultivo de macrófagos en RPMI-1640 + 10% de FCS. Si se requieren menores concentraciones de suero, el cultivo en medio RPMI-1640 con 1% de FCS también es posible. Semillas y células Incubar durante 3-4 horas. Después de este período, tenga en cuenta que los macrófagos se adhieren a la superficie del cultivo celular plato mientrasningún células contaminantes (es decir eritrocitos, linfocitos y células dendríticas) permanecen en suspensión. Lavar las células al menos dos veces con PBS para eliminar las células no adherentes. </li><li> Para separar macrófagos cultivados a partir de la placa de cultivo de células para experimentos adicionales, raspar cuidadosamente de la superficie. Alternativamente, se incuban los platos durante 20 min en hielo, aspirar el medio de cultivo, y añadir tampón de disociación celular libre de enzimas 1 ml. Después de 5 min de incubación a 37 ° C, añadir 4 ml de PBS, y separar las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo durante al menos 3 min. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar que no existe conflicto de intereses.

Los macrófagos son importantes las células efectoras del sistema inmune innato y muestran funciones importantes en la inmunomodulación, la presentación de antígenos y la homeostasis del tejido. Debido a su notable plasticidad, que son capaces de responder a diferentes estímulos con los cambios de su fenotipo. Sin embargo, se obtienen hasta ahora una gran cantidad de datos con respecto a la polarización de los macrófagos en el sistema murino, aunque hay informes que muestran que sólo alrededor del 50% de los marcadores de polarización de macrófagos puede ser traducido directamente del ratón a humano 16. Por lo tanto, se presenta aquí un método para obtener los macrófagos humanos primarios en número y en pureza suficiente sin la necesidad de materiales costosos, por ejemplo, perlas magnéticas MACS o un dispositivo de elutriación centrífuga a contracorriente. Nuestro método se basa en el aislamiento de monocitos a partir de PBMCs y su posterior diferenciación a los macrófagos en FEP recubierto de teflón bolsas de cultivo celular en presencia de bajo concentrations de M-CSF 11-13. Mientras que los monocitos representan menos del 5 al 10% de los leucocitos de sangre periférica en los seres humanos, tras la estimulación que son reclutados a los sitios periféricos donde se diferencian a macrófagos tisulares residentes o células dendríticas 17. La citoquina M-CSF es importante para la supervivencia de monocitos y acciona su diferenciación a los macrófagos 18,19. Hasta el momento, las concentraciones de M-CSF que fueron elegidos para la diferenciación de los monocitos variaban hasta 100 ng / ml, sin embargo, en nuestro protocolo somos capaces de obtener un número suficiente de macrófagos maduros con una concentración de M-CSF de sólo 2,5 ng / ml 12 , 20. Además, las células se cultivan en bolsas recubiertas de Teflon FEP de cultivo celular que facilitan el desprendimiento de los macrófagos y su posterior siembra en el número de células definidas. Dado que las bolsas se pueden reutilizar varias veces, esto disminuye aún más los costes para el proceso de aislamiento. Los macrófagos obtenidos por este procedimientoson altamente positivos para CD45, CD14, CD11b, CD11c y mostrar expresión del CD206 receptor de manosa que argumenta a favor de una población de, macrófagos maduros puros 21,22. Especialmente alta expresión de CD14 es típico para los macrófagos diferenciados en presencia de M-CSF 23. Después de la siembra de las células, muestran una adhesión rápida a las superficies de plástico con algunas células que muestran una morfología típica de tipo huso, mientras que otros exhiben un fenotipo huevo frito. Esto está de acuerdo con las observaciones de otros autores 18,22,24. Se informó de que la diferenciación de monocitos en presencia de M-CSF conduce a macrófagos polarizadas-M2 16,25. Sin embargo, los macrófagos aislados por nuestro protocolo todavía son capaces de responder a una amplia gama de estímulos incluyendo la exposición a microvesículas derivados de células tumorales y co-cultivo con células tumorales 26,27 o la exposición a LPS a los que reaccionan con la inducción de pro genes inflamatorios tales como IL-1 y# 946 ;, TNFa, Wnt5a o varias metaloproteinasas de la matriz que se consideran típicos de macrófagos polarizadas-M1 3,5,28. En conclusión, el aislamiento de monocitos por doble centrifugación en gradiente de densidad y la posterior diferenciación hacia macrófagos en recubiertos con teflón FEP bolsas de cultivo celular resulta en un elevado número de macrófagos y sin la necesidad de procedimientos técnicamente difíciles o caros. Los macrófagos obtenidos pueden ser utilizados para el análisis posterior que van desde clásica a través de la activación de LPS a la co-cultivo con células tumorales.

Las células de la estirpe monocítica y sus derivados terminales diferenciadas - macrófagos - muestran una plasticidad notable en lo que respecta a su función biológica, con miras a su participación en procesos tan diversos como el desarrollo, la reparación de tejidos, y la inmunidad 1. Esto último se debe a su capacidad fagocítica y presentadora de antígeno que sitúa los macrófagos en la encrucijada entre la respuesta inmune innata y adaptativa 2. Sin embargo, su capacidad para secretar citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y otras moléculas de señalización 1 no sólo aumenta su función inmuno-moduladora sino que también sirve como base para sus funciones adicionales. Los intentos de reflejar estas diversas etapas de activación en el contexto de la no-microbianas condiciones mediadas han dado lugar a las categorías M1 y M2 3. Aunque esta clasificación no es completa, permite un conocimiento básico de la biología de los macrófagos. Debido a estas capacidades multifacéticas que no es ninguna sorpresa que los macrófagos están asociados con muchas condiciones que de alguna manera implican la remodelación tisular o inflamación. Junto a su papel fundamental en el reconocimiento y liquidación de los patógenos invasores 4-6, macrófagos han llegado cada vez más en el foco en la aterosclerosis, fibrosis, la obesidad y el cáncer de 7-10. Un método reproducible para la generación de macrófagos humanos es por lo tanto crucial para la comprensión de estas patologías. Aquí presentamos un método basado en el aislamiento de monocitos humanos de la sangre periférica de donantes sanos mediante una técnica de doble centrifugación en gradiente de densidad como se ha descrito anteriormente 11. Con el fin de facilitar la diferenciación hacia los macrófagos, las células monocíticas aislados se incuban en presencia de bajas concentraciones de M-CSF y suero humano normal 12. Para facilitar aún más el manejo y la cosecha celular, la diferenciación se lleva a cabo en el gas permeable FEPBolsas de cultivo celular recubiertos de teflón con una superficie hidrófoba 12-15. Los macrófagos en reposo resultantes pueden ser sometidos a una amplia gama de ensayos, ya que todavía son capaces de responder, ya sea en un modo M1 o M2-similares. Los métodos alternativos de aislamiento de monocitos y la posterior diferenciación tales como la clasificación de células activadas magnético (MACS) o elutriación centrífuga (CCE) tienen algunas limitaciones en cuanto al rendimiento, el coste y tiempo requerido. El protocolo descrito en el presente documento ofrece la ventaja de que puede llevarse a cabo con equipo de laboratorio estándar sin la necesidad de reactivos especiales (por ejemplo, perlas magnéticas MACS) o dispositivos (por ejemplo, aparatos CCE) y permite el procesamiento de grandes cantidades de células.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpos para el inmunofenotipado</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>por ejemplo: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), control de isotipo IgG1-PE (A07796), control de isotipo IgG1-FITC (A07795)</td></tr><tr><td></td><td>BioLegends</td><td></td><td>por ejemplo: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>AnaSpec</td><td>89201</td><td></td></tr><tr><td>Conos de cierre con tapón combinado</td><td>Braun</td><td>4495101</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, sin Ca y Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td>para PBS-EDTA (1 mM) añadir 1 ml de EDTA 0,5 M por 500 ml de PBS</td></tr><tr><td>10x PBS, sin Ca y Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1084211000</td><td>preparar una solución de 0,5 M en H2O, utilizar un filtro estéril</td></tr><tr><td>Tampón de disociación celular (sin enzimas, a base de PBS)</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td> Ficoll <td>inactivado por calor</td></tr><tr><td>(densidad 1.077 g/ml)</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón FITC</td><td>santa cruz</td><td>sc-2010</td><td></td></tr><tr><td>LPS de E.coli</td><td>Sigma</td><td>L8274</td><td>conc final: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Biochrom AG</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (densidad 1,131 g/ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa perfusora 50 ml</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>resuspender en metanol (c = 0,1 mg/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur desechables de plástico</td><td>LVL technologies 2655181</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rh M-CSF</td><td>ImmunoTools</td><td>11343117</td><td>Resuspender en 500 &micro; l H2O estéril (c = 100 ng/&micro; l), alícuota</td></tr><tr><td>RPMI-1640 con rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>11835-063</td><td></td></tr><tr><td>Papel de esterilización</td><td>VP grupo</td><td>3KFKFS230116</td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul tripán (0,4% p/v)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>FEP Bolsa de cultivo celular recubierta de teflón, pequeña</td><td>CellGenix</td><td>72-C</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de cultivo celular recubierta de teflón FEP, grande</td><td>CellGenix</td><td>197-C</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en bolsos cultivo celular recubiertos de teflón

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Los macrófagos humanos están implicados en una plétora de procesos patológicos que van desde enfermedades infecciosas al cáncer. Así que representan una herramienta valiosa para comprender los mecanismos subyacentes de estas enfermedades. Por lo tanto, se presenta un protocolo sencillo para el aislamiento de monocitos humanos a partir de capas leucocitarias, seguido de un procedimiento de diferenciación que resulta en altos rendimientos de los macrófagos. La técnica se basa principalmente en equipos de laboratorio comúnmente disponibles y por lo tanto proporciona una manera costo y tiempo efectivo para obtener grandes cantidades de macrófagos humanos. Brevemente, capas leucocitarias de donantes de sangre sanos se someten a una centrifugación en gradiente de densidad doble para cosechar los monocitos de la sangre periférica. Estos monocitos se cultivan a continuación en etileno propileno (FEP) recubiertos de teflón bolsas fluorados de cultivo de células en presencia de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Los macrófagos diferenciados pueden ser cosechados y utilizados para estudios posteriores y funcional con la misma facilidaddice. Métodos importantes para el control de calidad y validación de las medidas de aislamiento y diferenciación se resaltarán en el protocolo. En resumen, el protocolo descrito aquí permite a los científicos para aislar de forma rutinaria y reproducible macrófagos humanos sin la necesidad de herramientas de coste intensivo. Por otra parte, los modelos de enfermedades se pueden estudiar en un sistema humano singénica eludir el uso de macrófagos murinos.

La primera centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll produce una interfase blanca que contiene las PBMC (Figura 1A) es decir, linfocitos y monocitos. Esto puede ser confirmado a través de una tinción de May-Gruenwald (Figuras 1B y C) de las células recogidas que muestra tanto una alta relación núcleo / citoplasma (típico de los linfocitos) y Bean o núcleos en forma de anillo (típico de los monocitos). Cuando estas células se cargaron en un gradiente de densidad utilizando Percoll segundos, los monocitos se pueden separar más lejos de los linfocitos y de nuevo aparecerá como una interfase blanca (Figuras 1D-F). Para cada capa leucocitaria de la centrifugación en gradiente de densidad doble descrito produce rutinariamente 150 ± 40 x 10 6 monocitos que pueden diferenciarse a 70 ± 30 x 10 6 macrófagos (Figura 2) por capa leucocitaria. El rendimiento medio de los macrófagos20 preparaciones independientes fue 47 ± 14% del total de monocitos aislados. Después de la centrifugación en gradiente de Percoll que aún puede haber algunas células no monocíticas residuales presentes en la preparación, que es dependiente de la donación de sangre, así como en la precisión del proceso de aislamiento. Sin embargo, después de la fase de diferenciación de 6-7 días, la preparación consiste principalmente en macrófagos maduros (Figura 3), que se puede enriquecer aún más debido a su adherencia a las superficies de plástico, una característica que no es compartida por las células contaminantes al azar (Figuras 4A y B). Una vez chapado, la mayoría de los macrófagos muestran una morfología clásica &quot;huevo frito&quot;, mientras que también hay células con un fenotipo extendido huso-como (Figuras 4C y D). Esto se refleja en su distribución F-actina dentro de los grupos de citoplasma y de adhesión. Las células diferenciadasse caracterizan por la expresión de CD45, CD14, CD16, CD206 (receptor de manosa), CD11b y CD11c que son marcadores típicos de macrófagos maduros (Figura 5). La presencia de CD11b argumenta en contra de una diferenciación predominantemente dendríticas que es apoyado por el hecho de que las células son negativas para el marcador de células dendríticas CD209 (DC-SIGN). Después del proceso de diferenciación de las células permanecen funcionalmente y metabólicamente activo durante aproximadamente 5-7 días (Figura 6), ya que puede ser visualizado por tinción con calceína AM y su capacidad para tomar hasta vesículas extracelulares se desprenden de las células tumorales. Además, las células todavía pueden ser activadas como se muestra por ejemplo, para la estimulación con lipopolisacárido (LPS), que resulta en la expresión de varios genes pro-inflamatorios (Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Apariencia y composición de la PBMC- y monocitos-capa después de gradiente de densidad doble centrifugación. Fotografía que ilustra (A) la banda de PBMC después de la gradiente de Ficoll y (D) la fase de monocitos después de la centrifugación Percoll iso-osmótica. Tinciones May-Gruenwald de cytospin preparativos de la (B, C) ​​fracción PBMC y el restante (E, F) monocitos. Barra de escala = 200 micras en B y E, = 50 micras en C y F. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. Rendimiento de los monocitos y los macrófagos. Conteos celulares representativos de monocitos y macrófagos aislados de 20 leucocitaria capa preparations. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. micrografías y mediciones de tamaño de celda de monocitos y macrófagos. Microscopía de contraste de fase de suspensión celular monocítica antes (A) y después (B) diferenciación de los macrófagos. Correspondiente histogramas de tamaño de celda de monocitos (C) y macrófagos (D). Barra de escala = 100 m. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Morfología y la organización del citoesqueleto de los macrófagos adherentes. Microscopía de contraste de fase de los macrófagos adherentes antes (A) y después (B) la eliminación de la falta de adherenT células. Tinción (C, D) faloidina-TRITC de actina filamentosa en macrófagos adherentes, no estimuladas. Barra de escala = 100 micras en AC, 20 micras de D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. inmunofenotipo de macrófagos diferenciados. Citometría de flujo de los macrófagos después de 6 días de diferenciación en bolsas de cultivo celular recubiertas con Teflon FEP (indicado en rojo). Los controles de isotipo correspondientes se muestran en gris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 6. Captación de microvesículas celulares tumorales por macrófagos. Micrografías de macrófagos adherentes después de la exposición a la etiqueta-PKH26 microvesículas derivadas de células tumorales (rojo fluorescente). Las imágenes se superpusieron a la correspondiente (A) campo claro o (B) tinción citosólica con la viabilidad de colorante calceína AM. Las barras de escala = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Upregulation de IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, y MT1-MMP después de Stimumento de macrófagos con LPS (100 ng / ml) durante 24 h. La expresión génica se midió mediante RT-PCR cuantitativa a partir de muestras de ARN total (A) y normalizado en HPRT1 y GNB2L1 expresión. Los valores que se muestran son los cambios veces en comparación con el control sin tratar (media ± desviación estándar, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa e IL-6 en la inducción de la estimulación LPS se confirmó por ELISA (B) (media ± SD, * p &lt;0,05).

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

El objetivo general de este procedimiento es generar macrófagos humanos en alta cantidad y calidad utilizando equipos de laboratorio estándar. Esto se logra primero centrifugando sangre proveniente de capas leucocitarias en un gradiente de FI para recolectar las PMBC. A continuación, en un gradiente por célula, los monocitos se separan de los linfocitos.Luego, los monocitos se siembran en bolsas de cultivo celular recubiertas con teflón y se diferencian. Después de seis o siete días, los macrófagos se recolectan y siembran para estudios posteriores. Las células obtenidas deben expresar los marcadores típicos de macrófagos maduros y responder a diversos estímulos, como el cultivo conjunto con células tumorales o la estimulación con LPS. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el contracorriente, la centrifugación o la clasificación magnética activada de células, es que los macrófagos humanos pueden generarse con equipos lip estándar sin necesidad de reactivos o instrumentos costosos.Aunque este método es fácil de realizar, las personas nuevas en este procedimiento podrían tener dificultades para visualizar y separar las diferentes poblaciones celulares en los gradientes de densidad. Por lo tanto, una demostración visual de estos pasos ayudará a superar estas dificultades. Este protocolo se realiza por duplicado para facilitar el equilibrado de los rotores.Comience desinfectando dos bolsas de la fracción de capa leucocitaria procedente de sangre estratificada. Luego transfiera las capas leucocitarias a dos tubos de 50 mililitros para cada capa leucocitaria. Prepare tres tubos de 50 mililitros con 15 mililitros de solución FI call a temperatura ambiente a 1,077 gramos por mililitro.Ahora, agregue lentamente y con cuidado de 30 a 35 mililitros de capa esponjosa sobre cada tubo de FI call. Las capas no deben mezclarse; centrifugue estos tubos sin interrupción a 400 G durante media hora. A temperatura ambiente, entre las dos fases, se formará un anillo blanco de células mononucleares periféricas.Retire estas capas con una pipeta de plástico. Combine las capas de los tres tubos de cada donante en dos tubos de 50 mililitros por donante. Lave las células recogidas añadiendo P-B-S-E-D-T-A de un milimolar hasta la marca de 40 mililitros y luego centrifúguelas a 300 G durante 10 minutos sin frenado a temperatura ambiente.Ahora aspire y deseche los sobrenadantes. A continuación, repita la lavada y resuspenda los pellet en P-B-S-C-D-T-A, reúna los pellet de cada donante y añádalos a 20 mililitros de RPMI más FCS sin rojo de fenol. Ahora debe haber un tubo de células por donante.Ahora prepare la segunda mezcla para el gradiente de densidad mezclando 23,13 mililitros de solución Per Coll a temperatura ambiente con 1,87 mililitros de PBS 10X en un tubo de 50 mililitros. Prepare un tubo de la mezcla por cada dos muestras. A continuación, transfiera 23 mililitros de la mezcla a un tubo nuevo de 50 mililitros.Luego, agregue 27 mililitros de RPMI más FCS con rojo de fenol. El resultado es una solución osmótica por célula al 46% ISO. Ahora, para cada transferencia de donante, transfiera 25 mililitros de la solución al 46% a un tubo de 50 mililitros y coloque cuidadosamente encima la mezcla celular.Las dos fases deben distinguirse por sus colores sin interrupción. Centrifugue las células durante media hora a temperatura ambiente y a 550 G. Un anillo blanco de monocitos se acumulará entre las dos fases. Recoja estas células en un tubo de 50 mililitros con una pipeta de plástico.Lave los monocitos con P-B-S-E-D-T-A de un milimolar, aforado hasta la marca de 50 mililitros. Luego, centrifúgelos a 400 G sin interrupción durante 10 minutos a temperatura ambiente, deseche el sobrenadante y resuspenda los monocitos sedimentados en 20 mililitros de medio. A continuación, continúe con la siguiente sección.Este protocolo utiliza bolsas de cultivo recubiertas con Teflon FEP como cámara de cultivo. Comience estimando el número de monocitos recolectados. Los monocitos son grandes y a menudo tienen forma irregular.No cuente los linfocitos más pequeños. Si hay disponibles de 100 a 150 millones de células de un donante, prepare 180 mililitros de RPMI suplementado. Si hay menos células, prepare volúmenes de 30 mililitros de medio por cada 30 a 50 millones de células.En una alícuota de 20 mililitros, mezcle cuidadosamente las células en los 180 mililitros de medio preparado. Luego cargue la bolsa de cultivo con las células utilizando una jeringa perfu de 50 mililitros conectada al tapón de la bolsa de cultivo. Retire la jeringa, expulse el aire restante y tape el tapón con un cono.Ahora incube las bolsas durante seis a siete días con dióxido de carbono al 5 %. Después de seis a siete días de incubación, transfiera las bolsas de cultivo a hielo para cosechar las células; sumerja completamente las bolsas en hielo y déjelas enfriar de una a tres horas para desprender las células. A continuación, tire suavemente de las bolsas sobre un borde aproximadamente 10 veces.Luego desinfecte minuciosamente el exterior de las bolsas. Sustituya el cono de cierre por una jeringa de 50 mililitros. A continuación, aspire la suspensión celular y transfiérala a un tubo de 50 mililitros.Una vez recolectados todos los tubos, centrifúgalos a 400 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, aspira el sobrenadante y reúne todas las células en 10 mililitros de RPMI más FCS. Luego, cuenta las células como antes. Cuenta únicamente los macrófagos, ya que pueden estar presentes linfocitos residuales.Luego, utilice las células para la aplicación de interés para reutilizar las bolsas de cultivo. Lávelas dos veces con etanol al 70%. A continuación, llénelas con 50 mililitros de etanol al 70% e incúbelas durante la noche a temperatura ambiente; al día siguiente, enjuague las bolsas tres veces con PBS estéril.Luego envuélvalos en papel de esterilización y autoclávelos. Una bolsa puede reutilizarse fácilmente 10 veces el gradiente de densidad. Las centrifugaciones producen una interfase blanca que contiene linfocitos y monocitos.Aquí examinamos el primer gradiente de densidad. May Grunwald. La tinción de estas células muestra tanto una alta relación núcleo-citoplasma, típica de los linfocitos, como núcleos con forma de haba o en anillo, típicos de los monocitos.Estas tinciones muestran los resultados del segundo gradiente. Cada capa buffy produce aproximadamente 150 millones de monocitos, que pueden diferenciarse en unos 70 millones de macrófagos. En 20 preparaciones, el 47 % de los monocitos se convirtieron en macrófagos.Los macrófagos purificados pueden enriquecerse aún más mediante la adhesión a superficies de plástico, una característica que no comparten las células contaminantes. Una vez sembradas, la mayoría de los macrófagos muestran una morfología similar a un huevo frito, mientras que otros presentan un fenotipo alargado en forma de huso. Las células se caracterizan por la expresión de varios marcadores.Típico de macrófagos maduros. La expresión de CD11b argumenta en contra de una diferenciación dendrítica, al igual que la ausencia de expresión de CD209. Después de la diferenciación, las células permanecen funcional y metabólicamente activas durante cinco a siete días.La tinción de calcio en células viables muestra su capacidad para incorporar vesículas extracelulares marcadas con color rojo provenientes de células tumorales. Además, los macrófagos pueden activarse; por ejemplo, la estimulación con lipopolisacárido induce la expresión de varios genes proinflamatorios. Tras este procedimiento, los macrófagos aislados pueden someterse a un amplio espectro de ensayos funcionales con el fin de responder preguntas fundamentales sobre la biología de los macrófagos en la salud y la enfermedad.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar grandes cantidades de macrófagos humanos. Sin embargo, es importante recordar que está trabajando con muestras de sangre humana, que podrían ser potencialmente infecciosas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos el aislamiento de monocitos de sangre humana completa mediante separación inmunomagnética negativa. Los monocitos aislados se pueden utilizar para análisis posteriores.

Aislamiento de monocitos de sangre total por selección inmunomagnética negativa

Este video muestra el cebado de monocitos primarios en macrófagos. Los monocitos humanos primarios pueden aislarse y diferenciarse a un fenotipo proinflamatorio similar a M1 utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) o a un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 utilizando el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).

Cultivo in vitro y diferenciación de monocitos primarios en macrófagos

En este video, demostramos un procedimiento para inducir la diferenciación y polarización de monocitos derivados de sangre periférica en macrófagos M1 o M2. La incubación con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, lipopolisacárido e interferón-gamma produce macrófagos M1 proinflamatorios, mientras que la incubación con factor estimulante de colonias de macrófagos e interleucina-4 induce la producción de macrófagos M2 antiinflamatorios.

Diferenciación y polarización de células derivadas de monocitos en células similares a macrófagos

Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El protocolo utiliza la criopreservación de monocitos junto con su diferenciación masiva en macrófagos. Luego, los macrófagos cosechados se pueden sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

Este estudio compara dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para obtener células dendríticas (CD) in vitro. Los monocitos se seleccionan por adherencia o se enriquecen negativamente por separación magnética. Se comparará el rendimiento y la viabilidad de los monocitos junto con la viabilidad, la proliferación y la expresión de marcadores de superficie CD11c/CD14 entre ambos métodos.

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Aquí se presenta un protocolo optimizado para aislar, cultivar, transfectar y diferenciar a los monocitos primarios humanos de individuos infectados por el VIH y controles saludables.

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.

Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos

Aquí, presentamos un protocolo para investigar la interacción de macrófagos primarios derivados de monocitos humanos con un esferoide tumoral en una matriz tridimensional (3D) de colágeno I, con la posibilidad de comparar el impacto de las propiedades solubles y físicas del microambiente en la invasión celular.

Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

Los monocitos y macrófagos son células inmunitarias muy plásticas y reprogramables cruciales para la salud y la enfermedad. Perciben y responden a una amplia gama de estímulos mediante la adopción de programas de diferenciación y fenotipos específicos. Hemos estandarizado un modelo in vitro para estudiar la polarización y reprogramación de los macrófagos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación.

Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

Aprende a aislar monocitos humanos por centrifugación en gradiente de densidad doble y diferenciarlos a macrófagos en bolsas de cultivo recubiertas de teflón. Este método eficiente utiliza equipos de laboratorio estándar.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

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