Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

El objetivo general de este procedimiento es generar macrófagos humanos en gran cantidad y calidad con equipos de laboratorio estándar. Esto se logra primero centrifugando la sangre de los pelajes de Buffy en un gradiente de llamada FI para recolectar las P BMC cs. A continuación, en un gradiente por llamada, los monocitos se separan de los linfocitos.

A continuación, los monocitos se siembran en bolsas de cultivo celular recubiertas de teflón y se diferencian. Después de seis o siete días, los macrófagos se cosechan y se siembran para estudios posteriores. Las células obtenidas deben expresar los marcadores típicos de los macrófagos maduros y responder a diversos estímulos como el cocultivo con células tumorales o la estimulación con LPS, La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como el contraflujo, la centrifugación, o la clasificación de células activadas magnéticamente, es que los macrófagos humanos pueden generarse con equipos labiales estándar sin necesidad de costosos reactivos o instrumentos.

Si bien este método es fácil de realizar, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades para visualizar y separar las diferentes poblaciones celulares en los gradientes de densidad. Por lo tanto, la demostración visual de estos pasos ayudará a superar estas dificultades. Este protocolo se realiza por duplicado para facilitar el equilibrado de los rotores.

Comience desinfectando dos bolsas de la fracción de pelaje leucocitario de la sangre en capas. A continuación, transfiere las capas de Buffy a dos tubos de 50 mililitros para cada capa de buffy. Prepare tres tubos de 50 mililitros con 15 mililitros de solución FI a temperatura ambiente a 1,077 gramos por mililitro.

Ahora, lenta y cuidadosamente, aplique de 30 a 35 mililitros de capa hinchada en cada tubo de FI call. Las ponedoras no deben mezclarse, centrifugar estos tubos sin romperse a 400 G durante media hora. A temperatura ambiente, entre las dos fases, se formará un anillo blanco de células mononucleares de sangre periférica.

Retire estas capas con una pipeta de plástico. Combine las capas de los tres tubos de cada donante en dos tubos de 50 mililitros por donante. Lave las células recolectadas agregando un milimolar P-B-S-E-D-T-A hasta la línea de 40 mililitros, y luego centrifugue a 300 G durante 10 minutos sin romperse a temperatura ambiente.

Ahora aspire y descarte los sobrenadantes. A continuación, repetir el lavado y P-B-S-C-D-T-A resuspender y juntar los pellets de cada donante y 20 mililitros de RPMI más FCS sin rojo fenol. Ahora debería haber un tubo de células por donante.

Ahora prepare el segundo gradiente de densidad: mezcle 23,13 mililitros de solución a temperatura ambiente por llamada con 1,87 mililitros de 10 XPBS en un tubo de 50 mililitros. Prepare un tubo de la mezcla por cada dos muestras. A continuación, transfiera 23 mililitros de la mezcla a un nuevo tubo de 50 mililitros.

A continuación, añade 27 mililitros de RPMI más FCS con rojo fenol. El resultado es una solución osmótica ISO del 46% por llamada. Ahora, para cada transferencia de donante, se colocan 25 mililitros de la solución al 46% en un tubo de 50 mililitros y se coloca cuidadosamente la mezcla de células.

Las dos fases deben distinguirse por sus colores sin interrupción. Centrifugar las células durante media hora a temperatura ambiente y a 550 G. Un anillo blanco de monocitos se acumulará entre las dos caras. Recoja estas células en un tubo de 50 mililitros con una pipeta de plástico.

Lave los monocitos con un milimolar P-B-S-E-D-T-A, lleno hasta la marca de 50 mililitros. A continuación, centrifugarlos a 400 G sin romper durante 10 minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender los monocitos peletizados en 20 mililitros de medio. A continuación, continúe con la siguiente sección.

Este protocolo utiliza bolsas de cultivo recubiertas de teflón FEP como cámara de cultivo. Comience por estimar el número de monocitos recolectados. Los monocitos son grandes y, a menudo, de forma irregular.

No cuente los linfocitos más pequeños. Si se dispone de 100 a 150 millones de células de un donante, prepare 180 mililitros de RPMI suplementado. Si hay menos células, prepare volúmenes de 30 mililitros de medio por cada 30 a 50 millones de células.

En una alícuota de 20 mililitros, mezcle cuidadosamente las células con los 180 mililitros de medio preparado. A continuación, cargue la bolsa de cultivo con las células con una jeringa de perfu de 50 mililitros conectada al enchufe de la bolsa de cultivo. Retire la jeringa, expulse el aire restante y tape el tapón con un cono.

Ahora incube las bolsas durante seis o siete días con un 5% de dióxido de carbono. Después de seis a siete días de incubación, transfiera las bolsas de cultivo a hielo para cosechar las células, sumerja completamente las bolsas en hielo y déjelas enfriar durante una hora a tres horas para separar las células. A continuación, tire suavemente de las bolsas sobre un borde unas 10 veces.

A continuación, desinfecte a fondo el exterior de las bolsas. Reemplace el cono del enchufe con una jeringa de 50 mililitros. A continuación, extraiga la suspensión de la célula y transfiérala a un tubo de 50 mililitros.

Cuando se hayan recogido todos los tubos, gírelos a 400 G durante 10 minutos A temperatura ambiente, aspire ahora el sobrenadante y agrupe todas las células en 10 mililitros de RPMI más FCS. A continuación, cuente las celdas como antes. Solo cuente los macrófagos, ya que puede haber linfocitos residuales.

A continuación, utilice las celdas para la aplicación de interés para reutilizar las bolsas de cultivo. Lávelos dos veces con etanol al 70%. Luego llénelas con 50 mililitros de etanol al 70% e incubelas durante la noche a temperatura ambiente al día siguiente, enjuague las bolsas tres veces con PBS estéril.

Luego envuélvalos en papel de esterilización y autoclave. Una bolsa se puede reutilizar fácilmente 10 veces el gradiente de densidad. Las centrifugaciones producen una interfaz blanca que contiene linfocitos y monocitos.

Aquí examinamos el primer gradiente de densidad. May Grünwald. La tinción de estas células muestra una alta proporción de citoplasma del núcleo, típica de los linfocitos, y núcleos en forma de frijol o anillo, típicos de los monocitos.

Estas manchas muestran los resultados del segundo gradiente. Cada capa leucocitaria produce unos 150 millones de monocitos, que se pueden diferenciar en unos 70 millones de macrófagos. En 20 preparaciones, el 47% de los monocitos se convirtieron en macrófagos.

Los macrófagos purificados pueden enriquecerse aún más mediante la adherencia a las superficies de plástico, una característica que no comparten las células contaminantes. Una vez en platos, la mayoría de los macrófagos muestran una morfología de huevo frito, mientras que otros tienen un fenotipo similar al huso estirado. Las células se caracterizan por la expresión de varios marcadores.

Típico de los macrófagos maduros. La expresión de CD 11 B argumenta en contra de una diferenciación dendrítica, al igual que la falta de expresión de CD 2 0 9. Después de la diferenciación, las células permanecen funcional y metabólicamente activas durante cinco a siete días.

La tinción de calcio de las células viables muestra su capacidad para absorber las vesículas extracelulares marcadas con rojo que se desprenden de las células tumorales. Además, los macrófagos pueden activarse, por ejemplo, la estimulación con lipopolisacáridos da lugar a la expresión de varios genes proinflamatorios. Siguiendo este procedimiento, los macrófagos aislados pueden ser sometidos a un amplio espectro de ensayos funcionales con el fin de responder a preguntas básicas sobre la biología de los macrófagos en la salud y la enfermedad.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar grandes cantidades de macrófagos humanos. Sin embargo, es importante recordar que está trabajando con muestras de sangre humana, que podrían ser potencialmente infecciosas.