Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

El objetivo general de esta metodología es visualizar uno de los primeros pasos en la activación de una caspasas iniciadora. Este paso se denomina proximidad inducida y ocurre cuando las moléculas de caspasa se unen para formar dímeros activos durante la muerte celular apoptótica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las caspasas, como cuándo, dónde y con qué eficiencia se pueden activar las caspasas iniciadoras específicas.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede visualizar en tiempo real el ensamblaje de complejos de activación de caspasas en células vivas. Este método de complementación de fluorescencia biomolecular utiliza fragmentos de la proteína tiroxina, Venus, que se han infundido a una caspasa. Los fragmentos no son fluorescentes por sí solos, pero cuando la caspasa experimenta una proximidad inducida, esto une las dos mitades de Venus y se iluminan.

Para transfectar las células, primero agregue 12 microlitros del reactivo de transfección a 750 microlitros de medio sérico reducido en un tubo estéril. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada 10 nanogramos de un plásmido reportero a un tubo estéril de 1,5 mililitros para cada pocillo que se va a transfectar.

Agregue 20 nanogramos de cada plasma de caspasa BiFC a cada tubo. Lleve cada tubo a un volumen total de 100 microlitros agregando medios séricos reducidos. Con una pipeta P200, añada 100 microlitros de solución de reactivo de transfección a la mezcla de plásmidos gota a gota.

Después de incubar la mezcla de reactivos de transfección de plásmidos durante 20 minutos a temperatura ambiente, aspire el medio de las células con una pipeta o con succión. A continuación, con una pipeta P1000, pipetee suavemente 800 microlitros de medios sin suero por el lateral del pocillo. Con una pipeta P200, añada 200 microlitros del complejo lipídico de ADN gota a gota a cada pocillo.

Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados durante tres horas. Después de la incubación, extraiga el medio sin suero que contiene los complejos lipídicos de ADN por aspiración o con la pipeta, teniendo cuidado de no alterar la monocapa. Pipetee dos mililitros de medio de crecimiento completo precalentado suavemente por el costado de cada pocillo antes de incubar las células como se describe en el protocolo de texto.

Antes de la adquisición de datos, realice la inducción de la activación de caspasas como se describe en el protocolo de texto. Encienda el microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante e inicie el software de adquisición. Seleccione el objetivo de aceite 60x o 63x y coloque una gota de aceite sobre el objetivo.

A continuación, coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio utilizando el soporte de placa correcto. Encienda el calentador y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Concéntrese en la fluorescencia del reportero utilizando el láser o el filtro RFP.

Introduzca el porcentaje de potencia del láser al 50% y el tiempo de exposición a 100 milisegundos tanto para Venus como para RFP como punto de partida para determinar los ajustes óptimos que se utilizarán para el experimento. Active la captura en vivo e inspeccione la imagen resultante y los histogramas mostrados para ambos canales. Si la señal es baja y la imagen es difícil de distinguir, aumente el porcentaje de potencia del láser y/o el tiempo de exposición en incrementos hasta que la señal y la imagen se vean bien.

A continuación, seleccione o abra el módulo de pila Z en el software del microscopio. Ajuste el enfoque en una dirección hasta que la celda ya no sea visible. Seleccione esta como la posición superior.

Ajuste el enfoque en la dirección opuesta hasta que la celda ya no sea visible y seleccione esta como la posición inferior. Elija el tamaño de paso óptimo e inicie la adquisición. Si es necesario, ajuste el histograma de la pantalla para mejorar la apariencia visual de la señal fluorescente.

Por último, utiliza un software de renderizado tridimensional para reconstruir la imagen 3D. Si hay una fuente de dióxido de carbono disponible, coloque el dispositivo de suministro de dióxido de carbono encima del soporte de la placa. Establezca el nivel de dióxido de carbono en 5% y encienda el controlador de dióxido de carbono desde el software.

Navegue hasta un campo de células transfectadas. Visualice la imagen en vivo de las celdas adquiridas por la cámara y mostradas por el software de adquisición en la pantalla de la computadora utilizando el láser RFP. A continuación, introduzca los ajustes para el porcentaje de potencia del láser y el tiempo de exposición para el láser RFP.

A continuación, introduzca la configuración del porcentaje de potencia del láser y el tiempo de exposición para la luz láser YFP. Para cada pocillo de la placa, elija un número de posiciones diferentes que contengan una o más celdas que expresen el reportero. Introduzca el intervalo de tiempo entre cada fotograma de los lapsos de tiempo y el número total de fotogramas que se van a tomar.

Vuelva a visitar cada posición y corrija y actualice el enfoque según sea necesario. Comience el lapso de tiempo y guarde los datos. Por último, analice los datos utilizando el software de imágenes disponible como se describe en el protocolo de texto.

Aquí se muestra un ejemplo de caspasa-2 BiFC después de un daño en el ADN. Las células se trataron con un inhibidor de la topoisomerasa: la camptotecina. La proteína fluorescente roja, mCherry, se utilizó como indicador para mostrar que las células expresan la sonda BiFC y ayudar a visualizar el número total de células.

La fluorescencia de Venus se muestra en verde y los puntos grandes representan la proximidad inducida por la caspasa-2. Para proporcionar una visualización de alta resolución de la localización subcelular del complejo de activación de caspasas, se pueden obtener imágenes de células individuales en tres dimensiones. La activación de la caspasa-2 se muestra aquí en verde y el núcleo se muestra en rojo.

Se muestra la vista de cortes ortogonales de la celda donde el plano xy, el plano yz y el plano xz se pueden visualizar uno al lado del otro. La imagen tridimensional también se puede mostrar en una película en la que la celda gira alrededor del eje y. Para proporcionar datos cinéticos de caspasas, se pueden utilizar imágenes de lapso de tiempo BiFC.

Este vídeo muestra la activación de la caspasa-2 en verde tras el tratamiento con el inhibidor del proteasoma: Bortezomib. Las mitocondrias se muestran en rojo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar caspasa BiFC para rastrear el ensamblaje de los complejos de activación de caspasas en tiempo real y determinar claramente el tamaño, la forma y la localización de los complejos producidos.

Este protocolo describe algunos enfoques basados en el microscopio para recopilar los resultados del experimento BiFC de caspasa; Sin embargo, debe tenerse en cuenta que se pueden utilizar varias variaciones y combinaciones de estos enfoques para interrogar creativamente las vías de activación de las caspasas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir controles de artefactos inducidos por microscopía, como la fototoxicidad y el fotoblanqueo. El protocolo de texto adjunto incluye consejos para lograr esto.

La decisión de qué método de adquisición y análisis utilizar estará determinada por los perímetros que se explorarán y la disponibilidad de instrumentación y software de imágenes. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar enfoques de análisis de imágenes para interpretar los datos. Puede medir los cambios en la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo o el porcentaje de células fluorescentes.

También se puede calcular el número de focos o el tamaño del objeto.