Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es aislar y analizar la circulación de vesículas extracelulares en la sangre mediante dos métodos diferentes. Para el método de detección de vesículas extracelulares individuales, primero se aísla el plasma pobre en plaquetas o PPP a partir de una muestra de sangre.

El PPP se tiñe entonces con los anticuerpos conjugados con fluorocromo de interés. Para el método de detección basado en microesferas, las vesículas extracelulares se incuban con microesferas y luego las vesículas unidas a las microesferas se tiñen con los anticuerpos relevantes conjugados con fluorocromo. Finalmente, el contenido de vesículas extracelulares circulantes puede determinarse mediante el análisis de las muestras por citometría de flujo.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía electrónica o la separación con microperlas magnéticas es que es mucho más rápida y permite evaluar la población total de escal extracelular, en lugar de estar limitada a subpoblaciones específicas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que el éxito del mismo requiere una estricta adherencia a las maniobras demostradas y a los parámetros de configuración del citómetro. Para obtener datos de alta calidad con variaciones mínimas de un día a otro, comience por centrifugar muestras de sangre completa para separar el plasma de la capa leucocitaria (buffy coat) y los glóbulos rojos. A continuación, transfiera alícuotas de 1,2 mililitros del sobrenadante plasmático a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros, teniendo cuidado de no perturbar las capas inferiores que contienen la capa leucocitaria y los glóbulos rojos; luego centrifugue nuevamente el sobrenadante para eliminar cualquier plaqueta y fragmentos celulares grandes.

Al finalizar la centrifugación, transfiera cuidadosamente todo el líquido excepto los últimos 200 microlitros de las muestras de PPP a nuevos tubos, teniendo cuidado de no perturbar los pellets. Luego, mezcle el plasma moviendo el pistilo hacia arriba y hacia abajo varias veces y transfiera 320 microlitros de cada muestra a la fila superior de una placa de 96 pocillos. Para teñir las muestras, combine los anticuerpos de interés para cada uno de los tres paneles en tubos individuales de filtro centrífugo de 0,22 micrómetros y centrifugue los anticuerpos utilizando una centrífuga de ángulo fijo y velocidad única.

Cuando todo el anticuerpo haya pasado a través del filtro, agregue la cantidad adecuada de la mezcla a cada pocillo de la placa de 96 pocillos según se muestra en la figura. A continuación, utilice una pipeta multicanal para mezclar las muestras de PPP y luego transfiera 100 microlitros de cada muestra a los anticuerpos de la fila dos. Después mezcle nuevamente las muestras, cambie las puntas y transfiera 100 microlitros de muestra a cada una de las siguientes dos filas de anticuerpos según corresponda.

Para el experimento. Incube la placa a cuatro grados Celsius durante 30 minutos con 220 microlitros de PBS por pocillo desde la fila seis hasta la ocho dentro de una cabina de seguridad biológica. Luego, utilizando una pipeta multicanal de ancho ajustable, transfiera el contenido de cada pocillo a su correspondiente tubo de filtro centrífugo sin cambiar las puntas.

Utilice 200 microlitros de PBS de una de las filas de lavado para enjuagar los pocillos de los que se acaban de retirar las muestras. Luego, transfiera la solución de enjuague a los mismos filtros a los que previamente se agregaron las muestras de PPP y cierre los filtros centrífugos. Una vez que todas las muestras teñidas de PPP se hayan transferido junto con sus soluciones de enjuague, centrifugue las muestras en una centrífuga con rotor fijo.

Después de la centrifugación, asegúrese de que no quede líquido sobre los filtros. Luego, re suspenda las partes superiores de los filtros en 300 microlitros de PBS y transfiera el contenido re suspendido a tubos previamente etiquetados para análisis inmediato por citometría de flujo. El lavado de las muestras marcadas mediante filtros centrífugos mejora la separación entre las señales de marcadores positivos y el fondo.

Es importante tener en cuenta, sin embargo, que algunas de las vesículas extracelulares más pequeñas, incluidos los exosomas, podrían perderse a través de los poros del filtro. Para analizar las muestras, primero configure los parámetros de voltaje de dispersión directa y dispersión lateral en escala logarítmica y seleccione los umbrales más bajos permitidos por el citómetro para cada parámetro. Luego, mientras ejecuta un tubo con PBS filtrado de cero punto 22 micrómetros, ajuste estos voltajes a los valores más altos que excluyan la mayor parte del ruido de fondo. A continuación, ejecute un tubo que contenga una mezcla de microesferas de un micrómetro y más pequeñas, y trace una compuerta alrededor de la población de microesferas en un gráfico de dispersión directa frente a dispersión lateral para capturar todos los eventos por debajo de las microesferas de un micrómetro.

Ahora configure el citómetro en flujo bajo y utilice las perlas para ajustar el dial de velocidad de flujo del citómetro a la tasa de eventos deseada. Luego, utilizando un tubo de partículas fluorescentes arcoíris diluidas en PBS, adquiera 5.000 eventos, registrando la intensidad media de los valores de dispersión hacia adelante, dispersión lateral y cada canal de color. Cuando todos los parámetros estén configurados, analice cada muestra exactamente durante uno o dos minutos. Después de completar la primera lectura de cada tubo, mezcle 20 microlitros de MP 40 al 10 % en cada muestra y vuelva a leer los tubos durante el mismo período de tiempo, para permitir la resta de los eventos positivos detectados en la muestra lisada durante un intervalo igual.

Para detectar las vesículas extracelulares mediante captura basada en microesferas, comience por lavar dos veces las microesferas de poliestireno no recubiertas de seis micrómetros con medio RPMI, seguido de Resus en dos mililitros del mismo. A continuación, agregue 6.000 microesferas a cada nuevo tubo FACS, al tubo de control negativo añádale 400 microlitros de medio, y a todos los demás tubos 200 microlitros de PPP o vesículas extracelulares ultracentrifugadas según corresponda, y 200 microlitros de medio. Ajuste el volumen final en cada tubo a 400 microlitros.

Con más medio. Incube los tubos durante la noche a cuatro grados Celsius en agitación. A la mañana siguiente, lave las perlas con dos mililitros de medio.

Aspire el sobrenadante y bloquee cualquier unión no específica con 400 microlitros de albúmina sérica bovina al 5 %, coloque en un agitador a cuatro grados Celsius durante tres horas. Después de tres horas, lave las perlas con otros dos mililitros de medio y resuspenda los pellet en 100 microlitros de medio fresco. Ahora filtre los anticuerpos y añada el volumen adecuado de la mezcla de anticuerpos filtrada a cada tubo, y luego, tras 30 minutos a cuatro grados Celsius, lave las perlas con otros dos mililitros de medio.

En este momento, resuspenda los pellet en 400 microlitros de medio y analice inmediatamente las muestras mediante citometría de flujo, ajustando los parámetros de dispersión directa interna al umbral más bajo permitido por el citómetro de flujo, tal como se acaba de demostrar. Finalmente, seleccione la población de microesferas singletes y adquiera 2000 eventos por muestra. Tanto los métodos de detección individuales como los basados en microesferas pueden utilizarse para detectar la presencia de vesículas extracelulares en las muestras de PPP, como lo ilustran estos diagramas de dispersión. Para el ensayo de detección individual, se utiliza el control lisado para establecer las compuertas para la muestra correspondiente no listada.

La mayoría de los eventos debería caer dentro de la compuerta de vesículas extracelulares. Por ejemplo, en esta figura, estos gráficos biparamétricos mostraron la detección de los marcadores CD108A y CD235A, que son dos marcadores de glóbulos rojos conocidos por coexistir en las células. Como era de esperar, más de la mitad de los eventos positivos en las vesículas extracelulares son positivos para ambos marcadores, mientras que en estos gráficos biparamétricos, la expresión en vesículas extracelulares de dos marcadores que se sabe que no coexisten en las células exhibe poblaciones positivas separadas y distintas mediante el método de detección basado en microesferas.

No existe separación entre las poblaciones positivas y negativas y los eventos aparecen en los cuadrantes doble positivos, aunque normalmente no se encuentran en los mismos tipos celulares debido a que ambos tipos de vesículas extracelulares se unirán a una única perla. Por lo tanto, los datos obtenidos mediante este método se analizan mejor utilizando histogramas superpuestos con los datos del control negativo, observándose un desplazamiento aparente en la expresión del marcador en las muestras con perlas en comparación con los controles una vez dominado el procedimiento. Una vez perfeccionada, esta técnica puede utilizarse para analizar 12 muestras de sangre con tres paneles de anticuerpos en tres o cuatro horas con el método de detección individual, o en un día y medio mediante el método de perlas, si se realiza adecuadamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener la consistencia en el tratamiento de cada muestra, asegurarse de que la tasa de flujo del citómetro y las intensidades fluorescentes se hayan ajustado correctamente al inicio de cada experimento para coincidir con la configuración experimental del día anterior, especialmente al analizar múltiples muestras durante varios días.