Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es aislar y analizar la circulación de vesículas extracelulares en la sangre mediante dos métodos diferentes. Para el método de detección de vesículas extracelulares individuales. El plasma pobre en plaquetas o PPP se aísla primero de una muestra de sangre.

A continuación, la PPP se tiñe con los anticuerpos conjugados con fluorocromo de interés. Para el método de detección basado en perlas, las vesículas extracelulares se incuban con perlas y, a continuación, las vesículas unidas a perlas se tiñen con los anticuerpos conjugados con fluorocromo relevantes. En última instancia, el contenido de vesículas extracelulares circulantes se puede determinar mediante el análisis de las muestras por citometría de flujo.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía electrónica o la separación magnética de perlas, es que es mucho más rápida y permite evaluar la población total de escalones extracelulares en lugar de limitarse a subpoblaciones específicas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que el éxito de este método requiere un estricto cumplimiento de las maniobras demostradas y los parámetros de configuración del citómetro. Para producir datos de alta calidad con una variación diaria mínima, comience centrifugando muestras de sangre completa para separar el plasma de la capa de leucocitismo y los glóbulos rojos. A continuación, transfiera alícuotas de 1,2 mililitros del sobrenadante de plasma a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros, teniendo cuidado de no alterar las capas inferiores que contienen la capa leucocitaria y los glóbulos rojos, y luego centrifugue el sobrenadante nuevamente para eliminar las plaquetas y los fragmentos de células grandes.

Al final del centrifugado, transfiera con cuidado todos los microlitros de las muestras de PPP a tubos nuevos, excepto los últimos, teniendo cuidado de no alterar los gránulos. A continuación, mezcle el plasma hacia arriba y hacia abajo varias veces y transfiera 320 microlitros de cada muestra a la fila superior de una placa de 96 pocillos. Para teñir las muestras, combine los anticuerpos de interés para cada uno de los tres paneles en tubos de filtro centrífugo individuales de punto cero de 22 micrómetros y centrifuga los anticuerpos utilizando una centrífuga de ángulo fijo de una sola velocidad.

Cuando todo el anticuerpo haya pasado a través del filtro, agregue la cantidad adecuada de la mezcla a cada pocillo de la placa de 96 pocillos como se muestra en la figura. A continuación, utilice una pipeta multicanal para mezclar las muestras de PPP y, a continuación, transfiera 100 microlitros de cada muestra a los anticuerpos de la fila dos. A continuación, vuelva a mezclar las muestras, cambie las puntas y transfiera 100 microlitros de muestra a cada una de las dos filas siguientes de anticuerpos, según corresponda.

Para el experimento. Incubar la placa a cuatro grados centígrados después de 30 minutos a 220 microlitros de PBS por pocillo para hileras seis a ocho dentro de un gabinete de seguridad biológica. A continuación, utilizando una pipeta multicanal de anchura ajustable, transfiera el contenido de cada pocillo a su tubo de filtro centrífugo correspondiente sin cambiar las puntas.

Utilice 200 microlitros de PBS de una de las filas de lavado para enjuagar los pocillos de los que se acaban de extraer las muestras. A continuación, transfiera la solución de enjuague a los mismos filtros a los que se agregaron previamente las muestras de PPP y cierre los filtros centrífugos. Una vez que se hayan transferido todas las muestras de PPP teñidas junto con sus soluciones de enjuague, centrifugar las muestras en una centrífuga de rotor fijo.

Después del centrifugado, asegúrese de que no quede líquido en la parte superior de los filtros. A continuación, vuelva a suspender la parte superior de los filtros en 300 microlitros de PBS y transfiera el contenido resuspendido a tubos preetiquetados para un análisis citométrico de flujo inmediato. El lavado de las muestras teñidas con filtros centrífugos mejora la separación entre las señales de fondo y las señales de marcador positivas.

Sin embargo, es importante tener en cuenta que algunas de las vesículas extracelulares más pequeñas, incluidos los exosomas, pueden perderse a través de las puertas del filtro. Para analizar las muestras, primero, establezca los parámetros de voltaje de dispersión directa y lateral en una escala logarítmica y seleccione los umbrales más bajos permitidos por el citómetro para cada parámetro. Luego, mientras se ejecuta un tubo de cero coma 22 micrómetros, el PBS filtrado ajusta estos voltajes a los valores más altos que excluyen la mayoría del ruido de fondo. A continuación, ejecute un tubo que contenga una mezcla de cuentas, de un micrómetro o menos, y dibuje una puerta alrededor de la población de cuentas en un diagrama de dispersión hacia adelante para capturar todos los eventos debajo de las cuentas de un micrómetro.

Ahora configure el caudal del citómetro en bajo y use las perlas para ajustar el dial de caudal en el citómetro a la tasa de evento deseada. Luego, usando un tubo de partículas fluorescentes arco iris diluidas en PBS, adquiera 5.000 eventos, registrando la intensidad media de los valores para la dispersión lateral directa y cada canal de color. Cuando todos los parámetros estén establecidos, ejecute cada muestra durante exactamente uno o dos minutos Una vez completada la primera lectura de cada tubo, mezcle 20 microlitros de 10%MP 40 en cada muestra y vuelva a leer los tubos durante la misma cantidad de tiempo para permitir la sustracción de los eventos positivos detectados en la muestra lisada durante un período de tiempo igual.

Para detectar las vesículas extracelulares mediante captura basada en perlas, se debe comenzar lavando dos veces las perlas de poliestireno de seis micrómetros sin recubrimiento con medios RPMI, seguido de Resus en dos mililitros de las mismas. A continuación, agregue 6.000 perlas a cada nuevo tubo de fax al tubo de control negativo a 400 microlitros de medio a todos los demás tubos a 200 microlitros de PPP o vesículas extracelulares ultracentrífugas, según corresponda, y 200 microlitros de medio. Ajusta el volumen final de cada tubo a 400 microlitros.

Con más medios. Incubar los tubos durante la noche a cuatro grados centígrados en un agitador. A la mañana siguiente, lave las cuentas con dos mililitros de medio.

Aspirar el sobrenadante y bloquear cualquier unión inespecífica con 400 microlitros de albúmina sérica bovina al 5% en un agitador a cuatro grados centígrados durante tres horas. Después de tres horas, lave las perlas en dos mililitros más de medio y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de medio fresco. Ahora filtre los anticuerpos y agregue el volumen apropiado de cóctel de anticuerpos filtrados a cada tubo, y luego, después de 30 minutos a cuatro grados centígrados, lave las perlas en otros dos mililitros de medio.

Esta vez se resuspenden los pellets en 400 microlitros de medio y se analizan inmediatamente las muestras por citometría de flujo, ajustando los parámetros de dispersión interior hacia adelante al umbral más bajo permitido por el citómetro de flujo, como se acaba de demostrar. Por último, se puede observar la población de cuentas singlete y adquirir 2000 eventos por muestra. Tanto los métodos de detección individuales como los basados en perlas se pueden utilizar para detectar la presencia de las vesículas extracelulares en las muestras de PPP, como se ilustra en estos diagramas de puntos Para el ensayo de detección individual, el control lisado se utiliza para establecer las puertas para la muestra no listada correspondiente.

La mayoría de los eventos deben caer dentro de la puerta de la vesícula extracelular. Por ejemplo, en esta figura, estos gráficos biparamétricos mostraron la detección de los marcadores CD 1 0 8 A y CD 2 35 A, que son dos marcadores de glóbulos rojos que se sabe que coexisten en las células. Como era de esperar, más de la mitad de los eventos positivos en las vesículas extracelulares son positivos para ambos marcadores, mientras que en estos gráficos de parámetros, la expresión de vesículas extracelulares de dos marcadores que se sabe que no coexisten en las células exhibe poblaciones positivas separadas y distintas utilizando el método de detección basado en perlas.

No existe separación entre las poblaciones positivas y negativas y los eventos aparecen en los cuadrantes dobles positivos, a pesar de que normalmente no se encuentran en los mismos tipos de células debido al hecho de que ambos tipos de vesículas extracelulares se unirán a una sola perla. Por lo tanto, los datos de este método se analizan mejor utilizando histogramas superpuestos con los datos de control negativos, con un cambio aparente en la expresión del marcador observado en las muestras con cuentas en comparación con los controles una vez dominados. Esta técnica se puede utilizar para analizar 12 muestras de sangre con tres paneles de anticuerpos en tres o cuatro horas con el método de detección individual o en un día y medio mediante el método de perlas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser consistente en el tratamiento de cada muestra, asegúrese de que la tasa de flujo del citómetro y las intensidades fluorescentes se hayan ajustado correctamente al comienzo de cada experimento para que coincidan con la configuración experimental del día anterior, especialmente cuando se procesan varias muestras durante varios días.