Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

El objetivo general de este procedimiento es generar una red vascular humana in vivo. Esto se logra primero cultivando células formadoras de colonias endoteliales derivadas de sangre humana y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana. Ambos tipos celulares se mezclan luego en un gel basado en colágeno, el cual se inyecta por vía subcutánea en un ratón inmunodeficiente.

Siete días después, se extrae el implante y se evalúa la formación de una red vascular humana. En última instancia, la presencia de microvasos específicos humanos dentro de los implantes puede verificarse mediante histología e inmunohistoquímica. La principal ventaja de esta tecnología frente a un método invasivo como la implantación quirúrgica de constructos es que LED es sencillo y fácil de realizar, y no requiere cirugía.

Comience descongelando un vial de E CFCs y diluya inmediatamente las células en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de DMEM. Centrifugue la suspensión celular a 1200 RPM durante cinco minutos y resuspenda el botón celular en 10 mililitros de medio EGM dos tibio. A continuación, transfiera las células a una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros recubierta con gelatina al 1% e incube las células durante la noche en un incubador humedecido.

La mañana siguiente, aspire suavemente el medio y todas las células no unidas. A continuación, añada 10 mililitros de medio E GM dos fresco a las células unidas. Continúe este proceso durante los próximos días hasta que se forme una monocapa confluente.

Luego lave las células con 10 mililitros de PBS. Reemplace el PBS con dos mililitros de tripsina-EDTA y devuelva la placa al incubador durante cinco minutos. Después de cinco minutos, observe bajo un microscopio, golpee suavemente la placa y verifique si las células se han desprendido.

Si no es así, repita las incubaciones breves con agitación suave. Una vez que las células se hayan desprendido completamente, agregue ocho mililitros de medio EGM-2 a las células y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Cuente las células y centrifúguelas a 1200 RPM durante cinco minutos.

Ahora siembre las células en placas de cultivo celular recubiertas con gelatina al 1 % a una densidad de siembra de 5.000 células por centímetro cuadrado. Incube las células en medio EGM dos y renueve el medio cada dos o tres días con medio EGM dos. Repita este procedimiento para los pasajes subsiguientes entre los pasajes cuatro y ocho.

Las CFE-E estarán listas para usar. Este protocolo también puede utilizarse para cultivar MSC. Simplemente sustituya el medio E GM dos por medio M-S-C-G-M.

Utilice una placa de cultivo sin recubrir. Inicie el subcultivo al 80 % de confluencia y subcultive con una densidad de siembra de 10 000 células por centímetro cuadrado. Este experimento requiere 800 000 CFE-E y 1 200 000 CMM por implante.

Generalmente se preparan cinco implantes simultáneamente. Para comenzar, aspire el medio celular de las placas de cultivo y lave cada placa de células con 10 mililitros de PBS. Reemplace el PBS con dos mililitros de tripsina-EDTA e incube las placas con agitación suave.

Revise las células bajo un microscopio cada dos a cinco minutos hasta que todas las células se hayan desprendido. A continuación, agregue ocho mililitros de DMEM y recoja la solución celular. En un tubo cónico de 15 mililitros, cuente las células y transfiera la cantidad suficiente de células para cinco implantes a un solo tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, centrifugar las células a 1200 RPM durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante. Preparar cuidadosamente una mezcla de fibrinógeno y fibronectina colágena sobre hielo. A continuación, resuspender muy suavemente el sedimento celular en la mezcla fría con hielo.

Evitando la formación de burbujas de aire, cargue la suspensión celular en una jeringa de un mililitro y coloque una aguja de calibre 26 con tapa. Mantenga la jeringa cargada sobre hielo hasta que se inyecte la mezcla celular. Anestesie cuatro ratones inmunodeficientes desnudos atímicos de seis semanas de edad utilizando una cámara de isoflurano.

Una vez que los ratones estén anestesiados e insensibles al pellizco en los dedos de los pies, proceda con las inyecciones para cada ratón. Utilice una aguja de calibre 30 para inyectar 50 microlitros de soluciones de trombina por vía subcutánea en la región dorsal superior. En el mismo lugar, inyecte 200 microlitros de la mezcla de células.

Usando una aguja de calibre 26, las macromoléculas inyectadas se gelificarán y formarán un bulto pequeño pero apreciable bajo la piel. Después de la inyección, coloque los ratones sobre una capa de gasa para su comodidad y calidez. Obsérvelos hasta que recuperen la capacidad de moverse.

Durante los próximos tres días, realice una observación diaria de la salud general del animal. Una semana después de las inyecciones, sacrifique a los ratones con dióxido de carbono y extraiga quirúrgicamente el tapón de gel. Una vez recuperados, fotografíe los tapones de gel junto a una regla, luego coloque cada tapón de gel en un casete histológico y sumérjalos en formalina tamponada al 10 % durante toda la noche a temperatura ambiente.

Al día siguiente, lave el formol tamponado neutro al 10 % con agua destilada. Almacene las cassettes en PBS a cuatro grados Celsius hasta que se evalúen para evaluación histológica. Realice secciones de siete micrones del implante embebido en parafina.

Luego cuantifique la densidad de microvasos en la parte media de los implantes. Con la ayuda de una tinción con H y E, puntuar el número de vasos por milímetro cuadrado para demostrar la naturaleza humana de los vasos microvasculares. Tiña las secciones con un anticuerpo anti-CD31 humano disponible comercialmente en una dilución de uno a 100.

Esta imagen de contraste de fase muestra la morfología característica de empedrado de las células endoteliales en una monocapa típica y confluente de CFCs derivadas de sangre de cordón. Esta imagen muestra la morfología típica en forma de huso de las CMM derivadas de médula ósea humana. Después de una incubación de una semana en el hospedador murino, el implante marcado con una línea discontinua amarilla presentaba un aspecto muy diferente al de los tejidos del hospedador a mayor aumento.

Se observaron múltiples microvasos que revelaron sus estructuras luminadas que contienen glóbulos rojos y que están resaltadas por las flechas amarillas. Cuando se examinaron histológicamente los tapones, el lumen de los microvasos reaccionó con un anticuerpo monoclonal contra la proteína humana CD31. Los núcleos celulares fueron contratinados con hematina.

Una vez dominada, esta tecnología puede realizarse dentro de una onza si se lleva a cabo correctamente.