Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

El objetivo general de este procedimiento es generar una red vascular humana in vivo. Esto se logra cultivando primero células formadoras de colonias endoteliales derivadas de la sangre humana y células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana. Ambos tipos de células se mezclan en un gel a base de colágeno, que se inyecta por vía subcutánea en un ratón inmunodeficiente.

Siete días después, se extrae el implante y se evalúa para la formación de una red vascular humana. En última instancia, la presencia de microvasos humanos específicos dentro de los implantes se puede verificar a través de su histología e inmunohistoquímica. La principal ventaja de esta tecnología sobre un método ácido como la implantación quirúrgica de constructo es el LED, es simple y fácil de realizar, y no requiere cirugía.

Comience descongelando un vial de E CFC e inmediatamente diluya las células en un recipiente cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de DMEM. Gire la suspensión de la celda a 1200 RPM durante cinco minutos y Resus suspenda el pellet de la celda en 10 mililitros de medio EGM tibio dos. A continuación, transfiera las células a una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros recubierta con gelatina al 1% e incube las células durante la noche en una incubadora humidificada.

A la mañana siguiente, aspire suavemente el medio y las células no unidas. A continuación, alimente las células unidas con 10 mililitros de E GM dos medios frescos. Continúe este proceso durante los próximos días hasta que se haya formado una monocapa confluente.

A continuación, lave las células con 10 mililitros de PBS. Reemplace el PBS con dos mililitros de trips en EDTA y devuelva la placa a la incubadora durante cinco minutos. Después de cinco minutos bajo un microscopio, golpee suavemente la placa y verifique si las células se han desprendido.

De lo contrario, repita las incubaciones breves con un balanceo suave. Una vez que las células se hayan desprendido por completo, agregue ocho mililitros de medio EGM dos a las celdas y transfiera las celdas a una cónica de 15 mililitros. Cuente las celdas y gírelas hacia abajo a 1200 RPM durante cinco minutos.

Ahora coloque las células en placas de cultivo de tejidos recubiertas con gelatina al 1% a una densidad de asiento de 5.000 células por centímetro cuadrado. En medio EGM dos, incube las células y aliméntelas cada dos o tres días con medio EGM dos. Repita este procedimiento para los pasajes subsiguientes entre los pasajes cuatro y ocho.

Los E CFC estarán listos para su uso. Este protocolo también se puede utilizar para hacer crecer las MSC. Simplemente reemplace el medio E GM dos con el medio M-S-C-G-M.

Utilice una placa de cultivo sin recubrir. Comience el subcultivo al 80% de confluencia y el subcultivo a una densidad de siembra de 10.000 células por centímetro cuadrado. Este experimento requiere 800.000 E CFC y 1.200.000 MSC por implante.

Por lo general, se preparan cinco implantes simultáneamente. Para comenzar, aspire un medio celular de las placas de cultivo y lave cada placa de células con 10 mililitros de PBS. Sustituya el PBS por dos mililitros de tripsina EDTA e incube las placas con un suave balanceo.

Revise las células bajo un microscopio cada dos a cinco minutos hasta que todas las células se hayan desprendido. A continuación, añada ocho mililitros de DMEM y recoja la solución celular. En una cónica de 15 mililitros, cuente las células y transfiera suficientes células para cinco implantes a una sola cónica de 15 mililitros.

A continuación, gire las celdas a 1200 RPM durante cinco minutos y retire el snat. Prepare cuidadosamente una mezcla de fibrinógeno y colágeno fibronectina en hielo. A continuación, vuelva a suspender muy suavemente el pellet de celda en la mezcla helada.

Para evitar la formación de burbujas de aire, cargue la suspensión de la celda en una jeringa de un mililitro y coloque una aguja de calibre 26 con tapón. Mantenga la jeringa cargada en hielo hasta que se inyecte la mezcla de células. Anestesiaron a cuatro ratones inmunodeficientes desnudos atímicos de seis semanas de edad utilizando una cámara de flúor ISO.

Una vez que los ratones estén anestesiados y no respondan al pellizco de los dedos de los pies, proceda con las inyecciones para cada ratón. Utilice una aguja de calibre 30 para inyectar 50 microlitros de soluciones de trombina por vía subcutánea en la región dorsal superior. En el mismo lugar, inyecte 200 microlitros de la mezcla de células.

Usando una aguja de calibre 26, las macromoléculas inyectadas se gelificarán y formarán un pequeño pero apreciable bulto debajo de la piel. Después de la inyección, coloque los ratones sobre una capa de gasa para mayor comodidad y calor. Obsérvalos hasta que se vuelvan ambulatorios.

Durante los tres días siguientes, realice una observación diaria de la salud general del animal. Una semana después de las inyecciones, eutanasiar a los ratones con dióxido de carbono y retirar quirúrgicamente el tapón de gel. Una vez recuperados, fotografíe los tapones de gel junto a una regla, luego coloque cada tapón de gel en un casete histológico y sumérjalos en formina tamponada neutra al 10% durante la noche a temperatura ambiente.

Al día siguiente, lavar la formina tamponada al 10% de neutro con agua destilada. Guarde los casetes en PBS a cuatro grados centígrados hasta que se evalúen para la evaluación histológica. Hacer secciones de siete micras del implante incrustadas en parafina.

A continuación, cuantificar la densidad de microvasos en la parte media de los implantes. Con la ayuda de una tinción H y e, marque el número de vasos por milímetro cuadrado para demostrar la naturaleza humana de los vasos microvasculares. Teñir las secciones con un anticuerpo anti-humano CD 31 disponible comercialmente en una dilución de uno a 100.

Esta imagen de contraste de fase muestra la morfología característica de las células endoteliales en una monocapa confluente típica de CFC derivados de la sangre del cordón umbilical. Esta imagen muestra la morfología típica de la forma del huso de las MSC derivadas de la médula ósea humana. Después de una semana de incubación en el huésped del ratón, el implante marcado por una línea discontinua amarilla se veía muy diferente de los tejidos del huésped con un aumento mayor.

Se revelaron múltiples microvasos, sus estructuras luminales que contienen glóbulos rojos y están resaltadas por las puntas de flecha amarillas. Cuando se examinaron los tapones inmunohistoquímicos, la luz de los microvasos fue reactiva a un anticuerpo monoclonal contra el CD 31 humano. Los núcleos celulares se contratinieron con hematina.

Una vez dominada, esta tecnología se puede hacer en una onza si se realiza correctamente.